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Sep 06, 2023

De-novo-Design modularer und abstimmbarer Proteinbiosensoren

Naturband 591, Seiten

Nature Band 591, Seiten 482–487 (2021)Diesen Artikel zitieren

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Natürlich vorkommende Proteinschalter wurden für die Entwicklung von Biosensoren und Reportern für zelluläre und klinische Anwendungen umfunktioniert1. Allerdings ist die Anzahl solcher Schalter begrenzt und ihre Neukonstruktion eine Herausforderung. Hier zeigen wir, dass eine allgemeine Klasse proteinbasierter Biosensoren geschaffen werden kann, indem der Informationsfluss durch de novo entworfene Proteinschalter umgekehrt wird, bei denen die Bindung eines Peptidschlüssels biologische Ausgänge von Interesse auslöst2. Die entworfenen Sensoren sind modulare molekulare Geräte mit einem geschlossenen Dunkelzustand und einem offenen Lumineszenzzustand; Die Bindung des Analyten bewirkt den Wechsel vom geschlossenen in den offenen Zustand. Da der Sensor auf der thermodynamischen Kopplung der Analytbindung mit der Sensoraktivierung basiert, ist nur eine Zielbindungsdomäne erforderlich, was das Sensordesign vereinfacht und eine direkte Auslesung in Lösung ermöglicht. Wir entwickeln Biosensoren, die das Anti-Apoptose-Protein BCL-2, die IgG1-Fc-Domäne, den HER2-Rezeptor und Botulinumneurotoxin B empfindlich nachweisen können, sowie Biosensoren für kardiales Troponin I und einen Anti-Hepatitis-B-Virus-Antikörper mit hoher Empfindlichkeit erforderlich, um diese Moleküle klinisch nachzuweisen. Angesichts des Bedarfs an Diagnosetools zur Verfolgung des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2)3 haben wir diesen Ansatz genutzt, um Sensoren für das SARS-CoV-2-Spike-Protein und Antikörper gegen die Membran- und Nukleokapsidproteine ​​zu entwickeln. Ersteres, das einen de novo entwickelten RBD-Binder (Spike-Rezeptor-Bindungsdomäne)4 enthält, hat eine Nachweisgrenze von 15 pM und ein Lumineszenzsignal, das 50-fach höher ist als der Hintergrundwert. Die Modularität und Empfindlichkeit der Plattform dürften den schnellen Aufbau von Sensoren für ein breites Spektrum an Analyten ermöglichen und unterstreichen die Leistungsfähigkeit des De-novo-Proteindesigns zur Schaffung von Multi-State-Proteinsystemen mit neuen und nützlichen Funktionen.

Biosensoren auf Proteinbasis spielen eine wichtige Rolle in der synthetischen Biologie und in klinischen Anwendungen, aber die Entwicklung von Biosensoren beschränkte sich bisher größtenteils auf die Neukonstruktion natürlicher Proteine1. Das Auffinden spezifischer Analytbindungsdomänen, die bei der Bindung Konformationsänderungen erfahren, ist eine Herausforderung, und selbst wenn sie verfügbar sind, sind im Allgemeinen umfangreiche Protein-Engineering-Anstrengungen erforderlich, um sie effektiv an eine Reporterdomäne zu koppeln5,6. Daher ist es wünschenswert, modulare Biosensorplattformen zu konstruieren, die leicht für die Erkennung verschiedener interessierender Proteinziele umfunktioniert werden können. Zur Erkennung von Antikörpern7,8,9 und kleinen Molekülen10,11 wurden modulare Systeme entwickelt, aber allgemeine Proteinsensoren stellen angesichts der großen Vielfalt an Proteinstrukturen, -größen und Oligomerisierungszuständen sowie Ansätzen wie halbsynthetischen Proteinplattformen12,13,14 eine größere Herausforderung dar oder Calmodulin-Schalter15,16 erfordern aufgrund der begrenzten Vorhersagbarkeit in der Regel ein umfangreiches Screening, um potenzielle Kandidaten zu finden17.

Ein Proteinbiosensor kann aus einem System mit zwei nahezu isoenergetischen Zuständen aufgebaut werden, deren Gleichgewicht durch den erfassten Analyten moduliert wird. Wünschenswerte Eigenschaften eines solchen Sensors sind: (i) die durch einen Analyten ausgelöste Konformationsänderung sollte unabhängig von den Details des Analyten sein, sodass das gleiche Gesamtsystem zur Erkennung vieler verschiedener Ziele verwendet werden kann; (ii) das System sollte abstimmbar sein, sodass Analyten mit unterschiedlichen Bindungsenergien und unterschiedlichen typischen Konzentrationen über einen großen dynamischen Bereich nachgewiesen werden können; und (iii) die Konformationsänderung sollte an eine empfindliche Ausgabe gekoppelt sein. Wir stellten die Hypothese auf, dass diese Eigenschaften durch die Umkehrung des Informationsflusses in de novo entwickelten Proteinschaltern erreicht werden könnten, bei denen die Bindung an ein Zielprotein von Interesse durch die Anwesenheit eines Peptidaktors gesteuert wird2. Wir haben ein System entwickelt, das aus zwei Proteinkomponenten bestand: erstens einem „lucCage“, der eine Käfigdomäne und eine Latchdomäne umfasst, die ein Zielbindungsmotiv und ein gespaltenes Luciferasefragment (kleines BiT (SmBiT) 114) enthält18; und zweitens ein „lucKey“, der ein Schlüsselpeptid enthält, das an den offenen Zustand von lucCage und das komplementäre gespaltene Luciferase-Fragment (großes BiT (LgBit) 11S) bindet (Abb. 1a). lucCage hat zwei Zustände: einen geschlossenen Zustand, in dem die Käfigdomäne an den Riegel bindet und das Bindungsmotiv sterisch daran hindert, das Ziel zu binden, und SmBiT daran hindert, sich mit LgBit zu verbinden, um die Luciferase-Aktivität wiederherzustellen, und einen offenen Zustand, in dem sich diese Bindungsinteraktionen befinden nicht blockiert und lucKey kann sich an die Cage-Domäne binden. Die Assoziation von lucKey mit lucCage führt zur Wiederherstellung der Luciferase-Aktivität (Abb. 1a, rechts). Die Thermodynamik des Systems ist so abgestimmt, dass die freie Bindungsenergie von lucKey an lucCage (ΔGCK) nicht ausreicht, um die Kosten für freie Energie der lucCage-Öffnung (ΔGopen) in Abwesenheit des Ziels (ΔGopen − ΔGCK >> 0), aber in zu überwinden Bei Vorhandensein des Ziels treibt die zusätzliche freie Bindungsenergie des Latchs an das Ziel (ΔGLT) das Öffnen des Latchs und die Rekonstitution der Luciferase voran (ΔGopen − ΔGCK − ΔGLT << 0) (Abb. 1b, c). Dieses System erfüllt die oben genannten Eigenschaften (i) und (ii), da ein breites Spektrum an Bindungsaktivitäten blockiert werden kann und da der Schalter thermodynamisch gesteuert wird, können die lucKey- und Zielbindungsenergien angepasst werden, um eine Aktivierung bei den relevanten Zielkonzentrationen zu erreichen. Da lucKey und lucCage immer gleich sind, ist das System modular – die gleiche molekulare Assoziation kann an die Bindung vieler verschiedener Ziele gekoppelt werden. Biolumineszenz ermöglicht eine schnelle und empfindliche Auslesung der analytgesteuerten lucCage-lucKey-Assoziation und erfüllt die Eigenschaft (iii).

a, Schematischer Mechanismus des Sensors. Die geschlossene Form von lucCage (links) kann nicht an lucKey binden und verhindert so, dass das gespaltene Luciferase-SmBiT-Fragment mit LgBit interagiert. Die offene Form (rechts) kann sowohl an das Ziel als auch an den Schlüssel binden und ermöglicht so die Rekonstitution von SmBiT und LgBiT für die Luciferase-Aktivität. b, Thermodynamik der Biosensoraktivierung. Die Kosten für freie Energie (ΔGopen) des Übergangs vom geschlossenen Käfig (Art 1) zum offenen Käfig (Art 2) begünstigen die Assoziation des Schlüssels (Art 5) und die Wiederherstellung der Luciferase-Aktivität (Art 6) in Abwesenheit eines Ziels. In Gegenwart des Ziels überwinden die kombinierten freien Energien der Zielbindung (2→3; ΔGLT), der Schlüsselbindung (3→4; ΔGCK) und der SmBiT-LgBiT-Assoziation (4→7; ΔGR) den ungünstigen ΔGopen-Antrieb die Öffnung des lucCage und die Wiederherstellung der Luciferase-Aktivität. c, Thermodynamik des Biosensordesigns. Die gestaltbaren Parameter sind ΔGopen und ΔGCK; ΔGR ist für alle Ziele gleich und ΔGLT ist für jedes Ziel vorab festgelegt. Für einen empfindlichen Analytnachweis mit geringem Hintergrund müssen ΔGopen und ΔGCK so abgestimmt werden, dass der geschlossene Zustand (Spezies 1) eine wesentlich niedrigere freie Energie aufweist als der offene Zustand (Spezies 6) ohne Ziel, aber eine höhere freie Energie als der offener Zustand in Gegenwart des Ziels (Spezies 7).

Die Zustände dieses Biosensorsystems befinden sich im thermodynamischen Gleichgewicht, wobei die einstellbaren Parameter ΔGopen und ΔGCK die Populationen der möglichen Spezies bestimmen, zusammen mit der freien Assoziationsenergie des Analyten an die Bindungsdomäne ΔGLT (Abb. 1b). Wir haben die Abhängigkeit des Sensorsystems von ΔGopen (Extended Data Abb. 1a), ΔGLT (Extended Data Abb. 1b) und der Konzentration des Analyten und der Sensorkomponenten (Extended Data Abb. 1c, d) simuliert. Die Empfindlichkeit des Analytnachweises ist eine Funktion von ΔGLT, mit einer Untergrenze von etwa einem Zehntel der Dissoziationskonstante (Kd) für die Analytbindung (Extended Data, Abb. 1b). Oberhalb dieser Untergrenze ermöglicht die Variation der Konzentration von lucCage und lucKey dem System, auf unterschiedliche Bereiche der Zielkonzentration zu reagieren (Extended Data Abb. 1c, d). Die Empfindlichkeit kann weiter moduliert werden, indem die Stärke der intramolekularen Käfig-Latch-Wechselwirkung und der intermolekularen Käfig-Schlüssel-Wechselwirkung (ΔGopen bzw. ΔGCK) angepasst wird. Beispielsweise führt eine zu enge Käfig-Latch-Wechselwirkung zu einem niedrigen Signal in Gegenwart eines Ziels, und eine zu schwache Wechselwirkung führt zu einem hohen Hintergrundsignal in Abwesenheit eines Ziels (Extended Data Abb. 1a, e). Unsere Designstrategie zielt darauf ab, dieses Gleichgewicht zu finden, indem wir ΔGopen und ΔGCK modulieren, indem wir die Länge der Latch- (und Schlüssel-)Helix variieren und entweder günstige hydrophobe oder ungünstige vergrabene polare Wechselwirkungen an den Käfig-Latch- oder Käfig-Schlüssel-Grenzflächen einführen2 (Extended Data Abb . 1f, g).

Um auf diesen Prinzipien basierende Sensoren zu entwerfen, haben wir eine auf Rosetta basierende „GraftSwitchMover“-Methode entwickelt, um die Platzierung von Zielbindungspeptiden innerhalb des Riegels zu identifizieren, sodass das resultierende Protein im geschlossenen Zustand stabil ist und die Wechselwirkungen mit dem Ziel blockiert werden (ergänzende Methoden). ). Als ersten Test haben wir das SmBiT-Peptid und das BIM-Peptid im geschlossenen Zustand des zuvor beschriebenen optimierten asymmetrischen LOCKR-Schalters2 gepfropft (Extended Data Abb. 2). SmBiT nimmt innerhalb des Luciferase-Holoenzyms eine β-Strang-Konformation an, wir gingen jedoch davon aus, dass es im Kontext des helikalen Bündelgerüsts eine helikale Sekundärstruktur annehmen könnte, da die Sekundärstruktur kontextabhängig sein kann19. Wir haben unterschiedliche Platzierungen für die beiden Peptidsequenzen im Latch getestet, die Lösungen mit der niedrigsten Energie ausgewählt (Extended Data Abb. 2a) und 12 Designs in Escherichia coli exprimiert. Wir haben die Designs mit lucKey im Verhältnis 1:1 gemischt, dann BCL-2 hinzugefügt, das mit nanomolarer Affinität an BIM bindet20, und einen schnellen Anstieg der Lumineszenz beobachtet (Extended Data Abb. 2b, f; wir beziehen uns auf die besten davon als „lucCageBIM“), was zeigt, dass der umgekehrt betriebene LOCKR-Aktuator2 als Biosensor fungieren kann. Der Nachweisbereich des Analyten könnte durch Variation der Konzentration des Sensors (lucCage plus lucKey) abgestimmt werden (Extended Data Abb. 2g), wie in unseren Modellsimulationen erwartet (Extended Data Abb. 1c). lucCageBIM hat SmBiT an Position 312 im Latch (SmBiT312) (Extended Data Abb. 2d); Der Käfig mit dieser Platzierung (lucCage) wurde als Basisgerüst für die unten beschriebenen Biosensoren verwendet.

Als nächstes untersuchten wir die Integration einer Reihe von Bindungsmodalitäten für interessierende Analyten in lucCage, indem wir Methoden entwickelten, um zielbindende Proteine ​​anstelle von Peptiden rechnerisch im geschlossenen Zustand einzuschließen (ergänzende Methoden). Als Testfall haben wir das de novo entwickelte Influenza-A-H1-Hämagglutinin (HA)21-Bindungsprotein HB1.9549.2 in eine verkürzte Version des LOCKR-Switch22 (sCage) eingesperrt, die optimiert wurde, um die Stabilität zu verbessern und die Kristallisationsbemühungen zu erleichtern (Abb. 2a). Zwei der fünf Designs waren funktionsfähig und banden HA in Gegenwart, aber nicht in Abwesenheit eines Schlüssels (Erweiterte Daten, Abb. 3b). Die Kristallstruktur des besten Designs, sCageHA_267-1S, bestimmt mit einer Auflösung von 2,0 Å (Ergänzungstabelle 1, Code 7CBC der Proteindatenbank (PDB)), zeigte, dass alle HA-bindenden Schnittstellenreste außer einem (Phe273) mit der Käfigdomäne interagieren (Blockierung der Bindung des Latches an das Ziel), wie vom Design vorgesehen (Abb. 2a, Erweiterte Daten Abb. 3a–c).

a, Strukturvalidierung von sCageHA_267-1S, das ein entworfenes Influenza-Bindungsprotein in einem LOCKR-Schalter einschließt. Links, Designmodell des De-novo-Binders HB1.9549.2 (cyanfarbenes Band), gebunden an die Stammregion von Influenza-Hämagglutinin (HA, grünes Band)21. Rechts: Kristallstruktur (PDB-Code 7CBC) von sCageHA_267_1S, bestehend aus HB1.9549.2 (Cyan), gepfropft in eine verkürzte und stabilisierte Version des LOCKR-Schalters22 (sCage, gelbes Band). Mitte: Alle an der Bindung an HA beteiligten Reste von HB1.9549.2 (Magenta, oben) mit Ausnahme von F273 sind im geschlossenen Zustand des Schalters vergraben (unten). Die magentafarbenen Beschriftungen weisen auf den gleichen Satz an Aminosäuren in den beiden Feldern hin (z. B. entspricht F2 im oberen Feld F273 im unteren Feld). b–d, Funktionelle Charakterisierung von lucCageBot (b), lucCageProA (c) und lucCageHER2 (d). Links: Strukturmodelle integrieren einen de novo entwickelten Binder für BoNT/B (Bot.671.2)21 (b), die C-Domäne von Protein A (SpA C)23 (c) oder einen HER2-bindenden Affibody24 (d) in lucCage (blau). Band) mit Käfig-SmBiT-Fragment (Goldband). Mitte: Messung der Lumineszenzintensität nach Zugabe von 50 nM Analyt (BoNT/B (b), IgG Fc (c) oder HER2 (d)) zu einer Mischung aus 10 nM jedes lucCage und 10 nM lucKey. Rechts, Nachweis über einen weiten Bereich von Analytkonzentrationen durch Änderung der Konzentration des Biosensors (lucCage plus lucKey) (farbige Linien). Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, repräsentative Daten werden angezeigt und die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung

Mit dieser strukturellen Validierung des Designkonzepts versuchten wir als nächstes, Sensoren für Botulinumneurotoxin B (BoNT/B), die Immunglobulin-Fc-Domäne und den HER2-Rezeptor zu entwickeln. Wir haben einen de novo entwickelten Binder für Botulinum-Neurotoxin (Bot.0671.2)21, die C-Domäne des generischen Antikörper-bindenden Proteins A23 und einen HER2-bindenden Affibody24 in lucCage eingepfropft. Nach dem Screening einiger Designs für jedes Ziel (Extended Data Abb. 4, 5) erhielten wir hochempfindliche lucCages (lucCageBot, lucCageProA und lucCageHER2), die BoNT/B (Abb. 2b, Extended Data Abb. 4), menschliches IgG, erkennen können Fc-Domäne (Abb. 2c, Erweiterte Daten, Abb. 5a – d) und HER2-Rezeptor (Abb. 2d, Erweiterte Daten, Abb. 5e – h), was die Modularität der Plattform demonstriert. Die entwickelten Sensoren reagieren innerhalb von Minuten nach Zugabe des Ziels und ihre Empfindlichkeit kann durch Ändern der Konzentration von lucCage und lucKey angepasst werden (Abb. 2). Mit der weiteren Entwicklung könnten diese Sensoren den schnellen und kostengünstigen Nachweis von Botulinumneurotoxinen in der Lebensmittelindustrie25 und den Nachweis serologischer Konzentrationen von löslichem HER2 (>15 ng ml−1; innerhalb des Nachweisbereichs von lucCageHER2) im Zusammenhang mit metastasierter Brust ermöglichen Krebs26.

Als nächstes entwickelten wir Sensoren für kardiales Troponin I, den Standard-Biomarker für die Frühdiagnose bei akutem Myokardinfarkt27. Wir nutzten die hochaffinen Wechselwirkungen zwischen den kardialen Troponinen T, C und I (cTnT, cTnC bzw. cTnI) (Abb. 3a) und entwarfen 11 Biosensorkandidaten, indem wir 6 verkürzte cTnT-Sequenzen an verschiedenen Latch-Positionen einfügten (Extended Data Abb . 6a). Der beste Kandidat, lucCageTrop627, konnte cTnI nachweisen, jedoch nicht in ausreichend niedrigen Konzentrationen für den klinischen Einsatz, da die Ein- und Ausschlusswerte des cTnI-Assays für die Diagnose von Patienten mit akutem Myokardinfarkt im niedrigen pikomolaren Bereich liegen27. Da die Nachweisgrenze (LOD) unserer Sensorplattform etwa 0,1 × Kd der Latch-Target-Affinität (KLT) beträgt, versuchten wir, die Empfindlichkeit von lucCageTrop627 durch Erhöhung der cTnI-Bindungsaffinität zu verbessern. Wir haben cTnC an den C-Terminus des Sensors fusioniert, um die hochaffine Wechselwirkung zwischen den drei Herztroponinen zu nutzen (Extended Data Abb. 6b – d). Der resultierende Sensor, lucCageTrop, verfügt über einen einstelligen pikomolaren LOD, der für die Quantifizierung klinischer Proben geeignet ist (Abb. 3b, Erweiterte Daten Abb. 6e, f).

a, Design des cTnI-Sensors. Links: Struktur des kardialen Troponins (PDB-Code 4Y99). cTnT, cTnC und cTnI werden jeweils in Cyan, Grün und Magenta angezeigt. Rechts, Designmodell von lucCageTrop. b, Links, das Lumineszenzsignal steigt nach der Zugabe von 1 nM cTnI zu 0,1 nM lucCageTrop plus lucKey. Rechts, großer Erfassungsbereich zugänglich durch Veränderung der Konzentration der Sensorkomponenten (farbige Linien). Der graue Bereich zeigt den cTnI-Konzentrationsbereich an, der für die Diagnose eines akuten Myokardinfarkts relevant ist27; Die gestrichelte Linie zeigt den von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) festgelegten klinischen Grenzwert für einen akuten Myokardinfarkt (0,6 ng ml−1, 25 pM). c, HBV-Sensordesignmodelle (Gold, SmBiT; Grau, Linker; Magenta, HBV-preS1-Epitop). d, lucCageHBVα mit zwei Epitopkopien hat laut Biolayer-Interferometrie eine höhere Affinität für den Anti-HBV-Antikörper HzKR127-3.2 (Kd = 0,68 nM) als lucCageHBV (Kd = 20 nM). e, links, das Lumineszenzsignal steigt nach der Zugabe von 50 nM Anti-HBV-Antikörper zu 1 nM lucCageHBVα plus lucKey. Richtiger, empfindlicher Nachweis von Anti-HBV-Antikörpern über einen weiten Konzentrationsbereich. f, Mechanismus zum Nachweis von preS1 mit lucCageHBV. g, Kinetik der Biolumineszenz nach der Zugabe des Anti-HBV-Antikörpers ('1') und anschließend von preS1 ('2'), was die Biolumineszenz verringert, indem es mit dem Sensor um den Antikörper konkurriert. h, Der Nachweis von preS1 kann über die relevanten Konzentrationswerte nach der HBV-Infektion (grauer Bereich) durch Variation der Antikörperkonzentration (angezeigt durch farbige Markierungen) erreicht werden. Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, repräsentative Daten werden angezeigt und die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung

Der Nachweis spezifischer Antikörper ist wichtig für die Überwachung der Ausbreitung eines Krankheitserregers in einer Bevölkerung28, des Impferfolgs29 und der Konzentration therapeutischer Antikörper9. Um unser System für serologische Antikörperanalysen anzupassen, versuchten wir, lineare Epitope, die von den interessierenden Antikörpern erkannt werden, in lucCage zu integrieren. Wir haben zunächst einen Sensor für Antikörper gegen die preS1-Domäne des Oberflächenproteins L30 des Hepatitis-B-Virus (HBV) entwickelt. Das beste von acht getesteten Designs mit der Bezeichnung „lucCageHBV“ wies nach Zugabe des Anti-HBV-Antikörpers HzKR127-3.231 einen Anstieg der Luciferase-Aktivität um etwa 150 % auf (Extended Data Abb. 7a–d). Um den Dynamikbereich und die LOD von lucCageHBV weiter zu verbessern (Extended Data Abb. 7e), haben wir eine zweite Kopie des Peptids am Ende des Latchs eingeführt, um die Latch-Affinität mit dem bivalenten Antikörper (KLT) zu erhöhen (Abb. 3c, d). . Das resultierende Design mit der Bezeichnung „lucCageHBVα“ hatte eine LOD von 260 pM und einen Dynamikbereich von 225 % (Abb. 3e, Extended Data Abb. 7g–i), wobei die Lumineszenzintensität mit einer Kamera leicht erkennbar war (Extended Data Abb. 7j). Da die Konzentrationen der meisten therapeutischen Antikörper im Serum im niedrigen mikromolaren bis nanomolaren Bereich liegen9, sollte diese Plattform für die Überwachung der Konzentrationen therapeutischer Antikörper im Blutkreislauf nützlich sein32.

Als nächstes versuchten wir, den lucCageHBV-Sensor zum Nachweis von HBV-Oberflächenantigenen zu verwenden. Da unsere Sensoren unter thermodynamischer Kontrolle stehen, stellten wir die Hypothese auf, dass sich der vormontierte Sensor-Antikörper-Komplex in Gegenwart des Ziel-HBV-Oberflächenantigenproteins preS1 wieder ins Gleichgewicht bringen würde, wobei sich der Antikörper neu verteilt, um freies preS1 anstelle des Epitops auf lucCageHBV zu binden (Abb . 3f). Die Lumineszenz der Mischung aus lucCageHBV plus HzKR127-3.2 nahm kurz nach der Zugabe der preS1-Domäne ab (Abb. 3g); Die Empfindlichkeit dieser Anzeige ermöglichte die Quantifizierung der preS1-Konzentration im klinisch relevanten Bereich33 (Abb. 3h, Erweiterte Daten Abb. 7f).

Die COVID-19-Pandemie hat einen dringenden Bedarf an Diagnosetools sowohl für das SARS-CoV-2-Virus als auch für antivirale Antikörper geschaffen3. Um Sensoren für Anti-SARS-CoV-2-Antikörper zu entwickeln, haben wir zunächst aus der Literatur hochimmunogene lineare Epitope in den Proteomen von SARS-CoV34,35 und SARS-CoV-236 identifiziert, die in „häufigen“ Coronaviridae-Stämmen nicht vorhanden sind. Unter diesen konzentrierten wir uns auf zwei Epitope in den Membranproteinen (M) und Nukleokapsidproteinen (N), die von Seren von Patienten mit SARS und COVID-1935 erkannt werden,36 und für die kreuzreaktive tierische Antikörper im Handel erhältlich sind (Methoden). ). Wir haben Sensoren für jedes Epitop entworfen und Designs identifiziert, die spezifisch auf Anti-Membran- und Anti-Nukleokapsid-Antikörper reagierten (Erweiterte Daten, Abb. 8a, b). Diese Sensoren erreichten das volle Signal in 2–5 Minuten und hatten einen Dynamikbereich von etwa 50–70 % als Reaktion auf geringe nanomolare Mengen an Antikörpern (Abb. 4a, b, Erweiterte Daten Abb. 8c, d).

a, links, der lucCageSARS2-M-Sensor enthält zwei Kopien des SARS-CoV-2-Membranprotein-Epitops 1–17 (rot), verbunden mit einem flexiblen Abstandshalter. Mitte: Kinetik der Lumineszenzaktivierung von 50 nM lucCageSARS2-M plus lucKey nach Zugabe von 100 nM polyklonalen Anti-SARS-CoV-1-M-Kaninchen-Antikörpern (pAb), die mit den Resten 1–17 des SARS-CoV-1-M kreuzreagieren. 2 Membranprotein. Rechts: Reaktion von 5 nM lucCageSARS2-M plus lucKey auf unterschiedliche Konzentrationen des polyklonalen Ziel-Anti-M-Antikörpers. b, links, lucCageSARS2-N enthält zwei Kopien des Epitops des SARS-CoV-2-Nukleokapsidproteins 369–382 (hellblau). Mitte: Kinetik der Lumineszenzaktivierung von 50 nM lucCageSARS2-N plus lucKey nach Zugabe von 100 nM monoklonalem Anti-SARS-CoV-1-N-Maus-Antikörper (Klon 18F629.1), der das Epitop erkennt. Rechts: Reaktion von 50 nM lucCageSARS2-N plus lucKey auf unterschiedliche Konzentrationen von monoklonalen Anti-N-Antikörpern. c, links, lucCageRBD enthält einen de novo SARS-CoV-2 RBD-Binder4 (LCB1, Magenta). Mitte: Die Lumineszenzintensitäten nehmen nach der Zugabe von 16,7 nM SARS-CoV-2 RBD oder trimerem Spike-Protein zu einer Mischung aus 1 nM lucCageRBD plus lucKey zu. Rechts, Nachweis über einen Bereich von Analytkonzentrationen in Puffer, 10 % synthetischer Nasenmatrix38 oder 10 % Serum. d, Biosensor-Spezifität. Jeder Sensor wurde bei 1 nM mit 50 nM seines zugehörigen Ziels (magentafarbene Linien) und den Zielen für die anderen Biosensoren (graue Linien) inkubiert. Ziele sind BCL-2, BoNT/B, menschliches IgG Fc, HER2, cTnI, Anti-HBV-Antikörper (HzKR127-3.2), anti-SARS-CoV-1-M polyklonaler Antikörper und SARS-CoV-2 RBD. Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, repräsentative Daten werden angezeigt und die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung

Um Sensoren zu entwickeln, die SARS-CoV-2-Viruspartikel direkt erkennen können, haben wir einen de novo entwickelten pikomolaren Affinitätsbinder in die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) des SARS-CoV-2-Spike-Proteins namens LCB14 in das lucCage-Format integriert (Abb . 4c). Von den 13 getesteten Kandidaten konnte der beste, den wir als „lucCageRBD“ bezeichnen, sowohl monomeres RBD als auch das vollständige trimere SARS-CoV2-Spike-Protein37 mit 15 pM bzw. 47 pM LOD und einem dynamischen Bereich von mehr als 1.700 % nachweisen die RBD-Erkennung (Abb. 4c, Erweiterte Daten Abb. 9). Wir haben den Dynamikbereich von lucCageRBD weiter auf 5.300 % erhöht, indem wir die Käfig-Schlüssel-Affinität (KCK) durch Verkürzung von lucKey optimiert haben (Extended Data Abb. 10a – c). Zusätzlich zur Viruserkennung könnte der RBD-Sensor auch zur Überwachung der Antikörperbildung als Reaktion auf die Impfung verwendet werden, indem ein Konkurrenzformat verwendet wird, das dem oben für die Erkennung von HBV-Antikörpern beschriebenen analog ist (Abb. 3f) – die Fähigkeit, Reaktionen über einen weiten Bereich zu quantifizieren Dynamikbereich und die Unterscheidung neutralisierender Antikörper, die an der ACE2-Bindungsstelle auf dem RBD binden (und somit mit LCB1 im Sensor konkurrieren), von nicht neutralisierenden Antikörpern, die anderswo binden, sind potenzielle Vorteile gegenüber Lateral-Flow-Assays.

Um die Funktionsfähigkeit unserer Sensorplattform in komplexen biologischen Matrizen zu bewerten, verglichen wir den RBD-Nachweis durch lucCageRBD in Puffer, simulierter Nasenmatrix38 und menschlichem Serum und beobachteten nur eine geringfügige Verringerung der beiden letztgenannten Bedingungen (Abb. 4c). Einem Vorschlag von M. Merkx39 folgend, kontrollierten wir die Variation des absoluten Lumineszenzsignals in versetzten Serumproben von vier verschiedenen Spendern und versetzten simulierte Nasenmatrix unter Verwendung einer BRET-Referenz40 für die interne Kalibrierung und stellten fest, dass mit einer solchen Kalibrierung die RBD ohne genau quantifiziert werden konnte Dies beeinträchtigt den dynamischen Bereich des Sensors (Extended Data Abb. 11). Diese Ergebnisse legen nahe, dass das lucCage-System in Point-of-Care-Diagnosegeräten eingesetzt werden könnte.

Um die Spezifität der entwickelten Biosensoren zu testen, haben wir die Aktivierungskinetik jedes lucCage als Reaktion auf jedes der Ziele einzeln gemessen. Jeder Sensor reagierte schnell und empfindlich auf sein zugehöriges Ziel, jedoch nicht auf die anderen (Abb. 4d). Die tatsächlichen Sensoren (Ergänzungstabellen 2, 3) funktionierten größtenteils wie vom einfachen thermodynamischen Modell vorhergesagt. Beispielsweise deuten Experimente mit unterschiedlichen Schlüssel- und Sensorkonzentrationen auf eine geringe Kopplung zwischen Parametern hin. Allerdings gibt es zwischen verschiedenen Sensoren erhebliche Unterschiede im Aktivierungsgrad bei sättigenden Zielkonzentrationen oder hohen lucKey-Konzentrationen, der für die meisten niedriger ist als der, der für die vom Modell vorhergesagte vollständige Luciferase-Rekonstitution erwartet wird (Extended Data Abb. 10d – g, Ergänzung). Tabelle 4). Dies kann eine Folge einer sterischen Interferenz zwischen der Zielbindung an den Latch und der Luciferase-Rekonstitution sein, da das Zielbindungsmotiv und das Luciferase-SmBiT im Latch nebeneinander liegen; Solche Störungen könnten durch eine Vergrößerung des Abstands zwischen den beiden im Schalter behoben werden. Das Potenzial des lucCage-Systems wird durch den hohen Dynamikbereich (5.300 %) und die pikomolare Empfindlichkeit des lucCageRBD-Sensors veranschaulicht: Der nahezu optimale Kopen-Wert führt zu einem sehr niedrigen Hintergrund in Abwesenheit eines Ziels, ohne das Ausmaß der Aktivierung bei niedrigem Ziel zu beeinträchtigen Konzentrationen.

Es ist aufschlussreich, unsere Sensoren in den Kontext der vielen proteinbasierten Biosensorplattformen zu stellen, die im Laufe der Jahre mit beachtlichem Erfolg entwickelt wurden (Ergänzungsdiskussion, Ergänzungstabelle 5). Unsere Sensorplattform basiert auf der thermodynamischen Kopplung zwischen definierten geschlossenen und offenen Zuständen des Systems. Daher hängt ihre Empfindlichkeit von der Änderung der freien Energie ab, die nach der Bindung der Sensordomäne an das Ziel auftritt, nicht jedoch von der spezifischen Geometrie der Bindungswechselwirkung ( die halbsynthetischen Kleinmolekülsensoren10,11 verfügen ebenfalls über diese Eigenschaft). Dies ermöglicht den Einbau verschiedener Bindungsmodalitäten – darunter kleine Peptide, globuläre Miniproteine, Antikörperepitope und de novo entwickelte Bindemittel –, um empfindliche Sensoren für ein breites Spektrum von Proteinzielen mit geringer oder keiner Optimierung zu erzeugen. Für Point-of-Care-Anwendungen bietet unser System, ähnlich wie andere Biolumineszenz-basierte Protein-Biosensor-Plattformen8, die Vorteile, dass es homogen ist, kein Waschen erfordert und eine nahezu sofortige Anzeige ermöglicht; Die Quantifizierung der Lumineszenz kann mit kostengünstigen und zugänglichen Geräten wie der Kamera eines Mobiltelefons durchgeführt werden8. Im Krankenhausbereich könnte die Möglichkeit, Sensoren mit identischen Messwerten für unterschiedliche Ziele modular zu gestalten, die schnelle Auslesung einer großen Anzahl verschiedener Verbindungen mithilfe einer Reihe von Hunderten verschiedener Sensoren ermöglichen.

Bis vor kurzem lag der Schwerpunkt des De-novo-Proteindesigns auf dem Design von Proteinen mit neuen Strukturen, die einzelnen tiefen Minima der freien Energie entsprechen; Unsere Ergebnisse unterstreichen den Fortschritt auf diesem Gebiet, der nun die einfache Generierung komplexerer Mehrzustandssysteme ermöglicht. Ähnlich wie andere de novo entwickelte Proteine ​​werden unsere Sensoren in hohen Mengen in Zellen exprimiert und sind sehr stabil41, was ihre Herstellung und Verbreitung erheblich erleichtern dürfte. Wie die herausragende Leistung des lucCageRBD-Sensors zeigt, besteht eine starke Synergie zwischen der allgemeinen „molekularen Geräte“-Architektur unserer Plattform und de novo entwickelten hochaffinen Mini-Protein-Bindern4,21 (diese de novo Mini-Proteine ​​sind ebenfalls wirksam). mit anderen Plattformen42). Da die Leistungsfähigkeit des Computerdesigns weiter zunimmt, sollte es möglich werden, mithilfe von LucCage-Sensoren eine immer größere Bandbreite an Zielen mit höherer Empfindlichkeit zu erkennen. Über Biosensoren hinaus unterstreichen unsere Ergebnisse das Potenzial des De-novo-Proteindesigns, allgemeinere Lösungen für aktuelle Herausforderungen zu schaffen, als dies durch die Umnutzung nativer Proteine, die sich zur Lösung völlig anderer Herausforderungen entwickelt haben, erreicht werden kann.

Das SmBiT 114 (VTGYRLFEEIL)18 mit niedriger Affinität wurde mithilfe von GraftSwitchMover, einem auf RosettaScripts basierenden Proteindesign-Algorithmus, in den Riegel des zuvor beschriebenen asymmetrischen LOCKR-Schalters2 eingepfropft (Einzelheiten finden Sie unter „Ergänzende Methoden“). Der Pfropfprobenahmebereich wurde zwischen den Resten 300 und 330 festgelegt. Die resultierenden Designs wurden energieminimiert, visuell untersucht und für die anschließende Gensynthese, Proteinproduktion und biochemische Analysen ausgewählt. Die beste SmBit-Position auf dem Latch wurde experimentell als Einfügung am Rest 312 ermittelt, wie in Extended Data Abb. 2 beschrieben. Dieses Design wurde lucCage genannt. lucKey wurde durch genetische Fusion des LgBit von NanoLuc18 mit dem zuvor beschriebenen Schlüsselpeptid2 zusammengesetzt. Alle Proteinsequenzen sind in der Ergänzungstabelle 6 aufgeführt.

Für Peptide und Epitope wurde die Aminosäuresequenz für jede Sensordomäne mit Rosettascripts43 GraftSwitchMover in alle α-helikalen Register zwischen den Resten 325 und 359 von lucCage gepfropft. In den Fällen, in denen die gewünschte einzufügende Sequenz die Länge des lucCage-Latches überschritt, verwendeten wir Rosetta Remodel44, um die C-Terminus-Erweiterung von lucCage zu modellieren (Einzelheiten siehe ergänzende Methoden). Die resultierenden LucCages wurden mit Rosetta Fast Relax45 energieminimiert, visuell geprüft und typischerweise wurden weniger als zehn Designs für die anschließende Proteinproduktion und biochemische Charakterisierung ausgewählt.

Für Proteindomänen wurde das Hauptsegment des Sekundärstrukturelements identifiziert, das die Schnittstelle der Bindungsproteindomäne zum Ziel bildet. Die Aminosäuresequenz wurde extrahiert und mit dem GraftSwitchMover oder Rosetta Remodel wie oben beschrieben in lucCage eingepfropft. Anschließend verwendeten wir MergePDBMover und Pymol 2.0, um die Bindungsdomäne in voller Länge im Kontext des Schalters auszurichten, zu modellieren und zu visualisieren (Einzelheiten finden Sie unter „Ergänzende Methoden“). Die Designs wurden mit Rosetta Fast Relax energieminimiert und zur Auswahl visuell geprüft.

Die entworfenen Proteinsequenzen wurden für die E. coli-Expression codonoptimiert und als synthetische Gene in den E. coli-Expressionsvektoren pET21b+ oder pET29b+ angeordnet. Das synthetische Gen wurde an den NdeI- und

Der E. coli-Stamm Lemo21(DE3) (NEB) wurde mit einem pET21b+- oder pET29b+-Plasmid transformiert, das das synthetisierte Gen von Interesse kodiert. Die Zellen wurden 24 Stunden lang in LB-Medium, ergänzt mit Carbenicillin oder Kanamycin, gezüchtet. Die Zellen wurden im Verhältnis 1:50 ml in das mit Carbenicillin oder Kanamycin ergänzte Studier TBM-5052-Autoinduktionsmedium inokuliert, 2–4 Stunden bei 37 °C gezüchtet und dann weitere 18 Stunden bei 18 °C gezüchtet. Die Zellen wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 4.000 g und 4 °C gesammelt und in 30 ml Lysepuffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 30 mM Imidazol, 1 mM PMSF, 0,02 mg ml-1 DNase) resuspendiert. . Zellresuspensionen wurden durch Ultraschallbehandlung für 2,5 Minuten (5-Sekunden-Zyklen) lysiert. Die Lysate wurden durch 20-minütige Zentrifugation bei 24.000 g und 4 °C geklärt und durch 2 ml Ni-NTA-Nickelharz (Qiagen, 30250) geleitet, das mit Waschpuffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 30 mM Imidazol). Das Harz wurde zweimal mit 10 Säulenvolumina (CV) Waschpuffer gewaschen und dann mit 3 CV Elutionspuffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 300 mM Imidazol) eluiert. Die eluierten Proteine ​​wurden unter Verwendung von Ultra-15-Zentrifugalfiltereinheiten (Amicon) konzentriert und unter Verwendung einer Größenausschlusssäule Superdex 75 Improve 10/300 GL (GE Healthcare) in TBS (25 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl) weiter gereinigt. . Fraktionen, die Monomerprotein enthielten, wurden gepoolt, konzentriert und in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C gelagert.

Für alle In-vitro-Biolumineszenzmessungen wurde ein Synergy Neo2 Microplate Reader (BioTek) verwendet. Die Tests wurden in 50 % DPBS mit Kalzium (Gibco) plus 50 % Nano-Glo (Promega)-Testpuffer für cTnI-Sensoren durchgeführt und 50 % HBS-EP (GE Healthcare Life Sciences) plus 50 % Nano-Glo-Testpuffer wurden für andere verwendet Sensoren. 10× lucCage, 10× lucKey und 10× Zielproteine ​​der gewünschten Konzentrationen wurden zunächst aus Stammlösungen hergestellt. Für jede Vertiefung einer weißen, undurchsichtigen 96-Well-Platte wurden 10 μl 10× lucCage, 10 μl 10× lucKey und 20 μl Puffer gemischt, um die angegebene Konzentration und das angegebene Verhältnis zu erreichen. Die lucCage- und lucKey-Komponenten wurden 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, um eine Voräquilibrierung zu ermöglichen. Die Platte wurde 1 Minute lang bei 1.000 g zentrifugiert und weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 50 μl 50-fach verdünntes Furimazin (Nano-Glo-Luciferase-Assay-Reagenz, Promega) in jede Vertiefung gegeben. Bei Tests, die Serum oder simulierte Nasenmatrix (110 mM NaCl, 1 % (w/v) Mucin, 10 μg ml−1 menschliche genomische DNA38) enthielten, wurde die Pufferzusammensetzung durch die biologische Matrix ersetzt. Biolumineszenzmessungen in Abwesenheit eines Ziels wurden alle 1 Minute nach der Injektion durchgeführt (0,1 s Integration und 10 s Schütteln in den Intervallen). Nach etwa 15 Minuten wurden 10 μl seriell verdünntes 10-fach Zielprotein plus eine Blindprobe injiziert und die kinetische Erfassung der Biolumineszenz wurde insgesamt 2 Stunden lang fortgesetzt. Um die Werte der halbmaximalen effektiven Konzentration (EC50) aus dem Biolumineszenz-zu-Analyt-Diagramm abzuleiten, wurden die drei höchsten Biolumineszenz-Spitzenintensitäten bei einzelnen Analytkonzentrationen gemittelt, vom Blindwert abgezogen und zur Anpassung an die sigmoidale 4PL-Kurve verwendet. Um den LOD zu berechnen, wurde der lineare Bereich der Biolumineszenzreaktionen von Sensoren auf ihren Analyten extrahiert und eine lineare Regressionskurve erhalten. Es wurde verwendet, um die Standardabweichung der Antwort und die Steigung der Kalibrierungskurve (S) abzuleiten. Der LOD wurde bestimmt als: 3 × (sd/S).

Serumproben wurden aus überschüssigem Plasma oder Seren von Erwachsenen (>18 Jahre) beiderlei Geschlechts gewonnen, die vom Direktor der Abteilung für klinische Chemie des Krankenhauses der University Washington zur Verfügung gestellt wurden. Alle anonymisierten Spenderproben wurden anonymisiert bereitgestellt. Da die Spender damit einverstanden waren, dass ihre überschüssigen Proben für andere experimentelle Studien verwendet werden, konnten sie ohne zusätzliche Zustimmung in unsere Studie übernommen werden. Alle Proben wurden vor der Verwendung durch 0,22-μm-Filter geleitet. Zehn Mikroliter 10-fach seriell verdünntes monomeres RBD (167–0,69 nM), 5 μl 20-fach lucCage (20 nM), 5 μl 20-fach lucKey (20 nM), 5 μl 20-fach Antares2 (2 nM) und 10, 20, 25 oder 50 μl menschliches Spenderserum oder simulierte Nasenmatrix wurden mit 1:1 HBS:Nano-Glo-Assaypuffer gemischt, um ein Gesamtvolumen von 75 μl zu erreichen. Die Platte wurde 1 Minute lang bei 1.000 g zentrifugiert. Dann wurden 25 μl 25-fach verdünntes Furimazin in Puffer in jede Vertiefung gegeben. Biolumineszenzsignale wurden insgesamt 1 Stunde lang alle 1 Minute von den Kanälen 470/40 nm und 590/35 nm aufgezeichnet. Das Verhältnis zu jedem Zeitpunkt wurde anhand der in Erweiterte Daten Abb. 11b beschriebenen Gleichung berechnet. Monomeres SARS-CoV-2 RBD wurde wie zuvor beschrieben exprimiert und gereinigt46.

Protein-Protein-Wechselwirkungen wurden mit einem Octet RED96-System (ForteBio) unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten Biosensoren (ForteBio) gemessen. Jede Vertiefung enthielt 200 μl Lösung und der Testpuffer war HBS-EP+-Puffer (GE Healthcare Life Sciences, 10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05 % (v/v) Tensid P20) plus 0,5 % fettfreier Trockenmilch-Blot-Blocker (BioRad). Die Biosensorspitzen wurden 300 s lang mit 20 μg ml-1 Analytpeptid oder -protein beladen (Schwelle der 0,5-nm-Reaktion), 60 s lang in HBS-EP+-Puffer inkubiert, um die Grundlinienmessung zu erhalten, und in die Lösung getaucht, die Käfig und/oder oder Schlüssel für 600 s (Assoziationsschritt) und für 600 s in den HBS-EP+-Puffer getaucht (Dissoziationsschritte). Die Bindungsdaten wurden mit der ForteBio Data Analysis Software Version 9.0.0.10 analysiert.

Die BIM-Peptidsequenz (EIWIAQELRRIGDEFNAYYA) wurde in das lucCage-Gerüst eingefädelt, wie in „Computergestützte Grafting von Sensordomänen in lucCage“ beschrieben. Die ausgewählten Designs wurden in E. coli exprimiert, gereinigt und hinsichtlich der Lumineszenzaktivierung charakterisiert. Das Biolumineszenz-Detektionssignal wurde für jedes Design lucCage bei 20 nM gemischt mit lucKey bei 20 nM in Gegenwart oder Abwesenheit des Ziel-BCL-2-Proteins bei 200 nM gemessen. Rekombinantes BCL-2 wurde wie zuvor beschrieben hergestellt47.

Die Hauptbindungsmotive des De-novo-Binders Bot.0671.2, der Protein-A-Domäne C (SpaC) von Staphylococcus aureus, des HER2-Antikörpers und des De-novo-RBD-Binders LCB1 wurden in lucCage eingefädelt, wie in „Computergestütztes Grafting von Sensordomänen in lucCage“ beschrieben ( siehe Ergänzungstabellen 3 und 6 für Sequenzen). Die ausgewählten Designs wurden in E. coli exprimiert, gereinigt und hinsichtlich der Lumineszenzaktivierung charakterisiert. Die Designs wurden durch Messung des Biolumineszenzsignals für jedes Design lucCage bei 20 nM gemischt mit lucKey bei 20 nM in Gegenwart oder Abwesenheit von 200 nM Zielprotein gescreent. Die verwendeten Zielproteine ​​waren: Botulinumneurotoxin B HcB, exprimiert wie zuvor beschrieben48, menschliches IgG1-Fc-HisTag (AcroBiosystems, IG1-H5225) und menschliches HER2-HisTag (AcroBiosystems, HE2-H5225). Monomeres SARS-CoV-2-RBD und das trimere SARS-CoV-2-Spike-Protein (vorstabilisierte Hexapro-Version37) wurden wie zuvor beschrieben exprimiert und gereinigt46.

Die cTnT-Bindungsmotivsequenz wurde in Fragmente unterschiedlicher Länge gekürzt (Extended Data Abb. 6) und in das lucCage-Gerüst eingefädelt, wie in „Computergestütztes Pfropfen von Sensordomänen in lucCage“ beschrieben. Die ausgewählten Designs wurden in E. coli exprimiert, gereinigt und hinsichtlich der Lumineszenzaktivierung charakterisiert. Die Designs wurden durch Messung des Biolumineszenzsignals für jedes Design lucCage bei 20 nM gemischt mit lucKey bei 20 nM in Gegenwart oder Abwesenheit von 100 nM cTnI (Genscript, Z03320-50) gescreent. Anschließend wurde lucCageTrop, eine verbesserte Version durch Fusion an cTnC, durch genetische Fusion der folgenden Sequenz mit dem C-Terminus von lucCageTrop627 erstellt.

Das Bindungsmotiv (GANSNNPDWDFN) der preS1-Domäne wurde mit dem Rosetta GraftSwitchMover an jeder Position nach den Resten 336 in das lucCage-Gerüst eingefädelt. Gemäß dem Rosetta FastRelax-Protokoll wurden acht Designs für die Proteinproduktion ausgewählt. Die Designs wurden durch Messung des Biolumineszenzsignals für jedes Design lucCage (20 nM) und lucKey (20 nM) in Gegenwart oder Abwesenheit des Anti-HVB-Antikörpers HzKR127-3.2 (100 nM) gescreent, um lucCageHBV auszuwählen. Anschließend wurde lucCageHBVα konstruiert, indem eine Sequenz, die ein zweites antigenes Motiv (GGSGGGSSGFGANSNNPDWDFNPN) enthielt, genetisch mit lucCageHBV fusioniert wurde.

Antigene Epitope des SARS-CoV-2-Membranproteins (Aminosäuren 1–31, 1–17 und 8–24) und des Nukleokapsidproteins (Aminosäuren 368–388 und 369–382) wurden rechnerisch in lucCage eingepfropft, wie in „ beschrieben. Computergestütztes Pfropfen von Sensordomänen in lucCage. Die ausgewählten Designs wurden in E. coli exprimiert, gereinigt und hinsichtlich der Lumineszenzaktivierung charakterisiert. Alle Designs bei 50 nM wurden mit 50 nM lucKey gemischt und experimentell auf einen Anstieg der Lumineszenz in Gegenwart von polyklonalen Kaninchen-Anti-SARS-CoV-Membran-Antikörpern (ProSci, 3527) bei 100 nM oder monoklonalen Maus-Anti-SARS-CoV-Nukleokapsid-Antikörpern untersucht (Klon 18F629.1, NovusBio NBP2-24745) bei 100 nM.

HB1.9549.2 wurde für das sCage-Design an verschiedenen Positionen entlang der Latch-Helix des Gerüsts in das übergeordnete Sechs-Helix-Bündel eingebettet. Um günstigere intramolekulare Wechselwirkungen zu fördern, wurden drei aufeinanderfolgende Reste am Riegel absichtlich durch Glycin ersetzt, um Konformationsfreiheit zu ermöglichen. Die fünf Designs wurden in E. coli hergestellt. Die Biolayer-Interferometrieanalyse wurde mit gereinigten Käfigen (1 μM) und biotinyliertem Influenza A H1 HA21, geladen auf Streptavidin-beschichtete Biosensorspitzen (ForteBio), in Gegenwart oder Abwesenheit des Schlüssels (2 μM) unter Verwendung eines Octet-Instruments (ForteBio) durchgeführt.

Die synthetischen VH- und VL-DNA-Fragmente wurden in das pdCMV-dhfrC-cA10A3-Plasmid subkloniert, das die menschlichen Cγ1- und Cγ-DNA-Sequenzen enthält. Der Vektor wurde mit Lipofectamine (Invitrogen) in HEK 293F-Zellen eingeführt und die Zellen wurden in FreeStyle 293 (GIBCO) in 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C gezüchtet. Der Kulturüberstand wurde auf eine Protein-A-Sepharose-Säule (Millipore) geladen und der gebundene Antikörper durch Zugabe von 0,2 M Glycin-HCl (pH 2,7) eluiert, gefolgt von einer sofortigen Neutralisierung mit 1 M Tris-HCl (pH 8,0). . Die Lösung wurde gegen 10 mM HEPES-NaOH (pH 7,4) dialysiert und die Reinheit des Proteins durch SDS-PAGE analysiert.

Das DNA-Fragment, das für die preS1-Domäne (Reste 1–56) kodiert, wurde in das Plasmid pGEX-2T (GE Healthcare) kloniert und das Protein wurde im E. coli BL21(DE3)-Stamm (NEB) bei 18 °C als produziert Fusionsprotein mit Glutathion-S-Transferase (GST) am N-Terminus. Die Zelllysate wurden in einer Pufferlösung (25 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl) hergestellt und der geklärte Überstand wurde auf GSTBind Resin (Novagen) geladen. Die GST-preS1-Domäne wurde mit dem gleichen Puffer, der zusätzlich 10 mM reduziertes Glutathion enthielt, eluiert, unter Verwendung einer Größenausschlusssäule Superdex 75 Improve 10/300 GL (GE Healthcare) weiter gereinigt und auf 34 μM konzentriert.

sCageHA_267-1S und sCageHA_267-1S(E99Y/T144Y) wurden bei 18 °C im E. coli-Stamm LEMO21(DE3) (NEB) als Fusionsprotein exprimiert, das eine abgeleitete (His)10-markierte Cysteinproteasedomäne (CPD) enthielt von Vibrio cholerae49 am C-Terminus. Das Protein wurde mit HisPur-Nickelharz (Thermo), einer HiTrap Q-Anionenaustauschsäule (GE Healthcare) und einer HiLoad 26/60 Superdex 75-Gelfiltrationssäule (GE Healthcare) gereinigt. Für die Selenomethionin (SelMet)-Markierung wurde zusätzlich eine I30M-Mutation eingeführt, um eine sCageHA_267-1S(E99Y/T144Y/I30M)-Variante zu erzeugen. Dieses Protein wurde im RIL-Stamm E. coli B834 (DE3) (Novagen) im SeMet enthaltenden Minimalmedium exprimiert und nach dem gleichen Verfahren zur Reinigung der anderen Varianten gereinigt.

Zwei Punktmutationen (Glu99Tyr und Thr144Tyr) wurden eingeführt, um günstige Wechselwirkungen mit der Kristallpackung zu induzieren. Einkristalle von guter Qualität von sCageHA_267-1S(E99Y/T144Y/I30M) wurden in einer Dampfdiffusionsumgebung mit hängendem Tropfen durch Mikroimpfung in einer Lösung erhalten, die 11 % (v/v) Ethanol, 0,25 M NaCl, 0,1 M enthielt Tris-HCl (pH 8,5). Die Kristalle erforderten eine strikte Einhaltung der Temperatur von 25 °C. Zum Kryoschutz wurden die Kristalle kurz in der mit 15 % 2,3-Butandiol ergänzten Kristallisationslösung eingeweicht und im flüssigen Stickstoff blitzgekühlt. Am Se-Absorptionspeak wurde ein Datensatz mit anomaler Dispersion einer einzelnen Wellenlänge erfasst und mit HKL200050 verarbeitet. Die Se-Positionen und die anfängliche Elektronendichtekarte wurden mit dem AutoSol-Modul in PHENIX51 berechnet. Der Modellaufbau und die Strukturverfeinerung wurden mit COOT52 und PHENIX durchgeführt.

Zur Vorabbestimmung der Stichprobengröße wurden keine statistischen Methoden verwendet. Keine Probe wurde von der Datenanalyse ausgeschlossen und es wurde keine Verblindung vorgenommen. Nicht identifizierte klinische Serumproben wurden nach dem Zufallsprinzip zum Anreichern von Zielproteinen verwendet. Die Ergebnisse konnten mit verschiedenen Chargen reiner Proteine ​​an verschiedenen Tagen erfolgreich reproduziert werden. Sofern nicht anders angegeben, werden die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, und die Fehlerbalken in den Zahlen stellen den Standardstandard der technischen Dreifachangabe dar. Biolayer-Interferometriedaten wurden mit der ForteBio Data Analysis Software Version 9.0.0.10 analysiert. Alle Daten wurden mit GraphPad Prism 8 analysiert und grafisch dargestellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Artikel verlinkt ist.

Die Atomkoordinaten von sCageHA_267-1S wurden im PDB unter dem Zugangscode 7CBC hinterlegt. Die ursprünglichen experimentellen Daten, die die Ergebnisse dieser Arbeit stützen, sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Plasmide, die für die in diesem Artikel beschriebenen Biosensorproteine ​​kodieren, sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

Die im Manuskript verwendeten Designmodelle und RosettaScripts-Code wurden unter http://files.ipd.uw.edu/pub/de_novo_design_of_tunable_biosensors_2021/designcode_and_models.zip hinterlegt. Der Code für die in diesem Manuskript gezeigten numerischen Simulationen ist unter http://files.ipd.uw.edu/pub/de_novo_design_of_tunable_biosensors_2021/model_simulation.py verfügbar

Stein, V. & Alexandrov, K. Synthetische Proteinschalter: Designprinzipien und Anwendungen. Trends Biotechnologie. 33, 101–110 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Langan, RA et al. De-novo-Design bioaktiver Proteinschalter. Natur 572, 205–210 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Udugama, B. et al. Diagnose von COVID-19: die Krankheit und Hilfsmittel zur Erkennung. ACS Nano 14, 3822–3835 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cao, L. et al. De-novo-Design pikomolarer SARS-CoV-2-Miniprotein-Inhibitoren. Wissenschaft 370, 426–431.

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ja, H.-W. & Ai, H.-W. Entwicklung und Anwendungen von Biolumineszenz- und Chemilumineszenz-Reportern und Biosensoren. Annu. Rev. Anal. Chem. (Palo Alto, Kalifornien) 12, 129–150 (2019).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Greenwald, EC, Mehta, S. & Zhang, J. Genetisch kodierte fluoreszierende Biosensoren beleuchten die räumlich-zeitliche Regulierung von Signalnetzwerken. Chem. Rev. 118, 11707–11794 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Banala, S., Aper, SJA, Schalk, W. & Merkx, M. Schaltbare Reporterenzyme, die auf sich gegenseitig ausschließenden Domäneninteraktionen basieren, ermöglichen den Antikörpernachweis direkt in Lösung. ACS Chem. Biol. 8, 2127–2132 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Arts, R. et al. Nachweis von Antikörpern im Blutplasma mithilfe biolumineszierender Sensorproteine ​​und eines Smartphones. Anal. Chem. 88, 4525–4532 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

van Rosmalen, M. et al. Zweifarbige biolumineszierende Sensorproteine ​​zur therapeutischen Arzneimittelüberwachung von Antitumor-Antikörpern. Anal. Chem. 90, 3592–3599 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Yu, Q. et al. Halbsynthetische Sensorproteine ​​ermöglichen Stoffwechseltests am Point-of-Care. Science 361, 1122–1126 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Yu, Q. et al. Ein Biosensor zur Messung des NAD+-Spiegels am Point-of-Care. Nat. Metab. 1, 1219–1225 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schena, A., Griss, R. & Johnsson, K. Modulation der Proteinaktivität mithilfe angebundener Liganden mit sich gegenseitig ausschließenden Bindungsstellen. Nat. Komm. 6, 7830 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Arts, R. et al. Halbsynthetische biolumineszierende Sensorproteine ​​zum direkten Nachweis von Antikörpern und kleinen Molekülen in Lösung. ACS Sens. 2, 1730–1736 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xue, L., Prifti, E. & Johnsson, K. Eine allgemeine Strategie für die Semisynthese von ratiometrischen Fluoreszenzsensorproteinen mit erhöhtem Dynamikbereich. Marmelade. Chem. Soc. 138, 5258–5261 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Guo, Z. et al. Generalisierbare Proteinbiosensoren basierend auf synthetischen Schaltermodulen. Marmelade. Chem. Soc. 141, 8128–8135 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Edwardraja, S. et al. Käfigaktivatoren künstlicher allosterischer Proteinbiosensoren. ACS Synth. Biol. 9, 1306–1314 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ribeiro, LF, Warren, TD & Ostermeier, M. Konstruktion von Proteinschaltern durch Domäneninsertion und gerichtete Evolution. Methoden Mol. Biol. 1596, 43–55 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dixon, AS et al. Der NanoLuc-Komplementationsreporter ist für die genaue Messung von Proteininteraktionen in Zellen optimiert. ACS Chem. Biol. 11, 400–408 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Minor, DL, Jr & Kim, PS Kontextabhängige Sekundärstrukturbildung einer entworfenen Proteinsequenz. Nature 380, 730–734 (1996).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Kale, J., Osterlund, EJ & Andrews, DW Proteine ​​der BCL-2-Familie: wechselnde Partner im Tanz zum Tod. Zelltod ist unterschiedlich. 25, 65–80 (2018).

CAS PubMed Google Scholar

Chevalier, A. et al. Massiv paralleles De-novo-Proteindesign für gezielte Therapeutika. Natur 550, 74–79 (2017).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lajoie, MJ et al. Entwickelte Proteinlogik, um Zellen mit präzisen Kombinationen von Oberflächenantigenen anzugreifen. Science 369, 1637–1643 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Deis, LN et al. Unterdrückung der Konformationsheterogenität an einer Protein-Protein-Grenzfläche. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 112, 9028–9033 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eigenbrot, C., Ultsch, M., Dubnovitsky, A., Abrahmsén, L. & Härd, T. Strukturelle Basis für die hochaffine HER2-Rezeptorbindung durch ein manipuliertes Protein. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 107, 15039–15044 (2010).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hobbs, RJ, Thomas, CA, Halliwell, J. & Gwenin, CD Schneller Nachweis von Botulinumneurotoxinen – eine Übersicht. Toxine (Basel) 11, 418 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Perrier, A., Gligorov, J., Lefèvre, G. & Boissan, M. Die extrazelluläre Domäne von Her2 im Serum als Biomarker für Brustkrebs. Labor. Investieren. 98, 696–707 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rubini Gimenez, M. et al. Einstündiger Ein- und Ausschluss eines akuten Myokardinfarkts unter Verwendung von hochempfindlichem kardialem Troponin I. Am. J. Med. 128, 861–870.e4 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

Collins, MH Serologische Tools und Strategien zur Unterstützung von Interventionsversuchen zur Bekämpfung von Zika-Virus-Infektionen und -Erkrankungen. Trop. Med. Infizieren. Dis. 4, 68 (2019).

Artikel PubMed Central Google Scholar

Pondé, RAA Expression und Nachweis von Anti-HBs-Antikörpern nach Hepatitis-B-Virusinfektion oder Impfung im Rahmen der schützenden Immunität. Bogen. Virol. 164, 2645–2658 (2019).

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Chi, S.-W. et al. Ein weitgehend neutralisierender Anti-Hepatitis-B-Virus-Antikörper zeigt einen komplementaritätsbestimmenden Deckelöffnungsmechanismus der Region H3. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 104, 9230–9235 (2007).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, JH et al. Verbesserte Humanisierung und Affinitätsreifung des neutralisierenden Anti-Hepatitis-B-Virus-preS1-Antikörpers basierend auf der Antigen-Antikörper-Komplexstruktur. FEBS Lett. 589, 193–200 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Ovacik, M. & Lin, K. Tutorial zur Pharmakokinetik monoklonaler Antikörper und ihre Überlegungen in der frühen Entwicklung. Klin. Übers. Wissenschaft. 11, 540–552 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Locarnini, S. & Bowden, S. Hepatitis-B-Oberflächenantigen-Quantifizierung: nicht das, was es auf der Oberfläche zu sein scheint. Hepatology 56, 411–414 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chow, SCS et al. Spezifische Epitope der strukturellen und hypothetischen Proteine ​​lösen bei SARS-Patienten unterschiedliche humorale Reaktionen aus. J. Clin. Pathol. 59, 468–476 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

He, Y., Zhou, Y., Siddiqui, P., Niu, J. & Jiang, S. Identifizierung immundominanter Epitope auf dem Membranprotein des mit dem schweren akuten respiratorischen Syndrom assoziierten Coronavirus. J. Clin. Mikrobiol. 43, 3718–3726 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, H. et al. SARS-CoV-2-Proteom-Microarray zur Kartierung von COVID-19-Antikörperinteraktionen mit Aminosäureauflösung. ACS Cent. Wissenschaft. 6, 2238–2249 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hsieh, C.-L. et al. Strukturbasiertes Design präfusionsstabilisierter SARS-CoV-2-Spikes. Science 369, 1501–1505 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Panpradist, N. et al. Transfer von Tupferproben für die Point-of-Care-Diagnostik: Charakterisierung von Tupfertypen und manuelle Rührmethoden. PLoS ONE 9, e105786 (2014).

Artikel ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Ni, Y. et al. RAPPID: eine Plattform ratiometrischer Biolumineszenzsensoren für homogene Immunoassays. Vorabdruck unter https://doi.org/10.1101/2020.10.31.363044 (2020).

Ja, H.-W. et al. Rotverschobene Luciferase-Luciferin-Paare für eine verbesserte Biolumineszenzbildgebung. Nat. Methoden 14, 971–974 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baker, D. Was hat uns das De-novo-Proteindesign über Proteinfaltung und Biophysik gelehrt? Proteinwissenschaft. 28, 678–683 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, C. et al. Bottom-up-De-novo-Design funktioneller Proteine ​​mit komplexen Strukturmerkmalen. Nat. Chem. Biol. https://doi.org/10.1038/s41589-020-00699-x (2021).

Fleishman, SJ et al. RosettaScripts: eine Skriptsprachenschnittstelle zur makromolekularen Modellierungssuite Rosetta. PLoS ONE 6, e20161 (2011).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, P.-S. et al. RosettaRemodel: ein verallgemeinertes Framework für das flexible Backbone-Proteindesign. PLoS ONE 6, e24109 (2011).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Khatib, F. et al. Algorithmenentdeckung durch Proteinfaltungsspieler. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 108, 18949–18953 (2011).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Walls, AC et al. Auslösung starker neutralisierender Antikörperreaktionen durch entwickelte Protein-Nanopartikel-Impfstoffe gegen SARS-CoV-2. Zelle 183, 1367–382.e17 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Berger, S. et al. Computergestützte Inhibitoren mit hoher Spezifität beschreiben die Rolle von Proteinen der BCL2-Familie bei Krebs. eLife 5, e20352 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Jin, R., Rummel, A., Binz, T. & Brunger, AT Botulinumneurotoxin B erkennt seinen Proteinrezeptor mit hoher Affinität und Spezifität. Natur 444, 1092–1095 (2006).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Shen, A. et al. Mechanistische und strukturelle Einblicke in die proteolytische Aktivierung des Vibrio cholerae MARTX-Toxins. Nat. Chem. Biol. 5, 469–478 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Otwinowski, Z. & Minor, W. Verarbeitung von im Oszillationsmodus gesammelten Röntgenbeugungsdaten. Methoden Enzymol. 276, 307–326 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liebschner, D. et al. Bestimmung der makromolekularen Struktur mithilfe von Röntgenstrahlen, Neutronen und Elektronen: jüngste Entwicklungen bei Phenix. Acta Crystallogr. D 75, 861–877 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Potterton, L. et al. Entwicklungen im CCP4-Molekulargrafikprojekt. Acta Crystallogr. D 60, 2288–2294 (2004).

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Ja, H.-W. et al. ATP-unabhängige Biolumineszenz-Reportervarianten zur Verbesserung der In-vivo-Bildgebung. ACS Chem. Biol. 14, 959–965 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir bedanken uns für die Finanzierung durch HHMI (DB), die LG Yonam Foundation (B.-HO), das BK21 PLUS-Projekt von Korea (HL), das United World Antiviral Research Network (UWARN), eines der Zentren zur Erforschung neu auftretender Infektionskrankheiten (CREIDs). , NIAID 1 U01 AI151698-01 (DB, LS und H-.WY), The Audacious Project am Institute for Protein Design (DB, H-.WY, CMC und MCM), Eric und Wendy Schmidt auf Empfehlung der Schmidt Futures (AQ-.R. und H-.WY), die Washington Research Foundation (JP und MJL), der Nordstrom Barrier Institute for Protein Design Directors Fund (RAL), The Open Philanthropy Project Improving Protein Design Fund (DB und SEB), die Schenkungsunterstützung von Gree Real Estate (AQ-R.), der Stiftung „la Caixa“ (AQ-R., ID 100010434 im Rahmen des Zuschusses LCF/BQ/AN15/10380003), der Unterstützung 1U19AG065156-01 (DB) und dem Air Force Office of Scientific Research FA9550-18-1-0297 (DB). Wir danken M. Wener für die Sammlung anonymisierter menschlicher Serumproben, WC Van Voorhis für die Beratung und Unterstützung bei den Anti-SARS-CoV-2-Antikörpersensoren, N. Panpradist und B. Lutz für die Bereitstellung einer simulierten Nasenmatrix, S. Berger für Gemeinsames Teilen des BCL-2-Proteinziels, DA Silva Manzano für die Bereitstellung von Botulinumneurotoxin B, A. Kang für die Einrichtung von Screening-Kristallschalen und L. Carter, B. Fiala und das Institute for Protein Design für die Bereitstellung von SARS-CoV-2 RBD und Spike-Protein. Wir danken M. Merkx für den Vorschlag der internen BRET-Referenzierung zur Kontrolle von Probe-zu-Probe-Schwankungen der Luciferase-Aktivität. Die Röntgendaten wurden auf der Beamline 5C im Pohang Accelerator Laboratory, Korea, gesammelt. Alle Proteinstruktur- und Modellbilder wurden mit PyMOL 2.0 erstellt.

Jooyoung Park

Derzeitige Adresse: Sana Biotechnology, Inc, Seattle, WA, USA

Robert A. Langan, Scott E. Boyken und Marc J. Lajoie

Derzeitige Adresse: Outpace Bio, Inc., Seattle, WA, USA

Die folgenden Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Alfredo Quijano-Rubio, Hsien-Wei Yeh

Abteilung für Biochemie, Institut für Proteindesign, University of Washington, Seattle, WA, USA

Alfredo Quijano-Rubio, Hsien-Wei Yeh, Jooyoung Park, Robert A. Langan, Scott E. Boyken, Marc J. Lajoie, Longxing Cao, Cameron M. Chow, Mark C. Miranda, Lance Stewart, Byung-Ha Oh & David Bäcker

Abteilung für Bioingenieurwesen, University of Washington, Seattle, WA, USA

Alfredo Quijano-Rubio

Abteilung für Biowissenschaften, KAIST Institute for the Biocentury, Korea Advanced Institute of Science and Technology, Daejeon, Südkorea

Hansol Lee & Byung-Ha Oh

Abteilung für Systemimmunologie, College of Biomedical Science, Kangwon National University, Chuncheon, Südkorea

Jimin Wi & Hyo Jeong Hong

Howard Hughes Medical Institute, University of Washington, Seattle, WA, USA

David Baker

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DB leitete die Arbeiten. DB, AQ-R., H.-WY, B.-HO, JP und LS haben die Forschung entworfen und weiter konzipiert. AQ-R., JP, B.-HO und H.-WY führten das rechnerische Design der Sensoren durch. AQ-R., JP und B.-HO untersuchten die frühen Sensordesigns. H.-WY und AQ-R. optimierte das Design von Sensoren zur Verbesserung der Leistung und führte die experimentellen Charakterisierungen durch. H.-WY und AQ-R. führte die experimentelle Validierung durch. BHO leitete und HL führte die kristallographischen Arbeiten durch. H.-WY und RAL haben das thermodynamische Modell geschrieben und die Simulationen durchgeführt. RAL hat GraftSwitchMover geschrieben. SEB und MJL entwarfen den Elternkäfig und die wichtigsten Proteingerüste. LC hat den RBD-Ordner LCB1 entwickelt. CMC, MCM, JW und HJH führten eine Proteinreinigung durch. DB, B.-HO, AQ-R. und H.-WY schrieb den Originalentwurf. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und akzeptiert.

Korrespondenz mit Byung-Ha Oh oder David Baker.

DB, AQ-R., H.-WY und JP sind Miterfinder einer vorläufigen Patentanmeldung (Anmeldenummer 63/030.836, eingereicht von der University of Washington), die die in diesem Artikel beschriebenen Biosensoren abdeckt. DB, AQ-R., H.-WY, LC und LS sind Miterfinder einer vorläufigen Patentanmeldung (Anmeldenummer 63/051549, eingereicht von der University of Washington), die den in diesem Artikel beschriebenen SARS-CoV-2 RBD-Biosensor abdeckt . Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Informationen zum Peer-Review Nature dankt Caryn Bern, Vincent Hilser und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a–e, Numerische Simulationen der in Abb. 1b gezeigten gekoppelten Gleichgewichte für verschiedene Werte von Kopen (a), KLT (b), [lucKey]tot (c), [lucCage]tot (d) und Kopen (e). Sofern nicht anders angegeben, wurden die Simulationen mit festen Werten für Kopen = 1 × 10−3 M, KLT = 10−9 M und KCK = 10−8 M und einer Konzentration der Sensorkomponenten von 10:100 nM durchgeführt ([ lucCage]tot:[lucKey]tot). a: Eine Erhöhung von ΔGopen (kleineres Kopen) verschiebt die Sensorreaktion zu höheren Analytkonzentrationen. b, Die Sensor-LOD beträgt ungefähr 0,1 × KLT; Unterhalb dieser Konzentration wird die Antriebskraft zum Öffnen des Schalters zu schwach. c, d, Der effektive Zielerkennungsbereich kann durch Ändern der Konzentrationen der beiden Sensorkomponenten abgestimmt werden. Simulationsergebnisse, die in einer logarithmischen Skala (c) oder einer linearen Skala (d) für die Zielkonzentration dargestellt sind, veranschaulichen, dass die Steilheit der Reaktion vom Verhältnis der Sensorkonzentration zur Latch-Ziel-Bindungswechselwirkung (KLT) abhängt. e, KCK-Werte beeinflussen beide Spezies, die für den Hintergrund und das Signal verantwortlich sind (Spezies 6 bzw. 7 in Abb. 1b), was zu unterschiedlichen Sensordynamikbereichen führt. f, g, Simulationen mit verschiedenen Kopen- und KCK-Werten. Die Bildung der Spezies 6 (in Abb. 1b) wird durch große Kopen-Werte und starke lucCage-lucKey-Wechselwirkungen (KCK) erhöht. f, Eine Wärmekarte, die den berechneten Sensordynamikbereich gemäß den Kopen- und KCK-Werten darstellt. Kopen übt einen vorherrschenden Einfluss auf den Dynamikbereich aus, und KCK bietet eine zusätzliche Abstimmbarkeit um eine Ordnung. g: Eine Wärmekarte, die den Anteil der rekonstituierten Luciferase (Empfindlichkeit) bei sättigender Zielkonzentration zeigt, was auf einen Kompromiss bei der KCK-Abstimmung hinweist.

a, Proteinmodelle, die die unterschiedlichen Einfädelpositionen von SmBiT (Gold) und dem BIM-Peptid (Lachs) auf der Latch-Helix des De-novo-LOCKR-Schalters (blau) zeigen. b, Experimentelles Screening von 11 De-novo-BCL-2-Sensoren. Elf Varianten wurden durch Kombination der SmBiT- und BIM-Positionen in a erzeugt und durch Aktivierung ihrer Lumineszenz nach Zugabe von BCL-2 gekennzeichnet. Lumineszenzmessungen wurden mit jedem Design (20 nM) und lucKey (20 nM) in Gegenwart oder Abwesenheit von BCL-2 (200 nM) durchgeführt. SmBiT312-BIM339 (daher lucCageBIM) wurde aufgrund seiner höheren Helligkeit, seines Dynamikbereichs und seiner Stabilität für die posteriore Charakterisierung ausgewählt. c–g, Charakterisierung von lucCageBIM. c, Tragwerksentwurfsmodell in Banddarstellung. d, Nahaufnahme der vorhergesagten Grenzfläche von SmBiT (Gold) und Käfig (blau). e, Nahaufnahme der vorhergesagten Schnittstelle von BIM (Lachs) und Käfig (blau). f, Kinetische Lumineszenzmessungen nach Zugabe von BCL-2 (200 nM) zu einer Mischung aus lucCageBIM (20 nM) und lucKey (20 nM). g, Einstellbare Empfindlichkeit von lucCageBIM gegenüber BCL-2 durch Änderung der Konzentrationen der Sensorkomponenten (lucCageBIM und lucKey) (farbige Kurven).

a, Strukturmodelle von sCageHA-Designs mit dem eingebetteten De-novo-Binder HB1.9549.2. Das HB1.9549.2-Protein (cyan) wurde an verschiedenen Positionen entlang der Latch-Helix (magenta) in ein übergeordnetes Sechs-Helix-Bündel (sCage, gelb) eingepfropft, einschließlich dreier aufeinanderfolgender Glycinreste (grün). Die schwarzen Pfeile zeigen die zusätzlich eingeführte(n) einfache(n) V255S(1S)- oder doppelte(n) V255S/I270S(2S)-Mutation(en) auf dem Riegel an. b, Experimentelle Validierung von fünf sCageHA-Designs, die in Gegenwart oder Abwesenheit des Schlüssels an HA binden, durch Bioschichtinterferometrie. Die Konzentration der sCages und des Schlüssels betrug 1 μM bzw. 2 μM. Jedes Experiment wurde einmal durchgeführt. sCageHA_267-1S zeigte die höchste Aktivierungsfalte. c, Strukturvergleich, der die flexible Natur von sCage zeigt, um die Käfighaltung von HB1.9549.2 zu ermöglichen. Das Strukturmodell von sCage (grau) und die Kristallstruktur von sCageHA_267-1S (Gold) werden überlagert und ein schmaler Ausschnitt (schwarzer Kasten) wird für Details in einer orthogonalen Ansicht angezeigt. Die N-terminale Helix von HB1.9549.2 ist gegenüber der Latch-Helix (α6) um 3,2 Å (Mitte) verschoben, was gleichzeitig eine Verschiebung von α5 und eine teilweise Zerstörung eines Wasserstoffbrückennetzwerks mit Q16 und N214 von sCage (rechts) zur Folge hat. d, Eine Nahaufnahme der intramolekularen Wechselwirkungen von sCageHA_267-1S. Die HA-bindenden Reste sind in Magenta hervorgehoben. Sowohl die N-terminale Helix (Cyan α1) als auch die folgende Helix (Cyan α2) von HB1.9549.2 interagieren mit dem Käfig. Die intramolekularen Wechselwirkungen sind alle hydrophob. Die sperrige hydrophobe Seitenkette von F285 liegt eng an den Rückgratatomen von α5 von sCage an, was ohne eine Biegung von α5 wahrscheinlich nicht der Fall ist. Es werden auch ungünstige Wechselwirkungen gefunden: F273 ist dem Lösungsmittel ausgesetzt und die Hydroxylgruppe Y287 ist in der apolaren Umgebung verborgen. Das Feld ganz rechts zeigt die Qualität der Elektronendichtekarte.

a, Strukturmodelle der BoNT/B-Sensordesigns, die die verschiedenen Einfädelpositionen von Bot.0671.2 (grün, PDB-Code 5VID) auf dem Riegel von lucCage (blau) zeigen. Das SmBiT-Peptid wird in der Goldbanddarstellung dargestellt. I328S und L345S weisen auf Mutationen hin, die eingeführt wurden, um die Latch-Käfig-Schnittstelle abzustimmen („1S“ bezeichnet I328S, „2S“ bezeichnet I328S/L345S)2 und „GGG“ weist auf das Vorhandensein von drei aufeinanderfolgenden Glycinresten zwischen dem Latch und dem gepfropften Protein hin. Die schwarze Box zeigt eine Nahaufnahme der Schnittstelle zwischen Käfig (blau) und Bot.0671.2 (grün) im 349_2S-Design. b, Experimentelles Screening von neun De-novo-BoNT/B-Sensoren. Lumineszenzmessungen wurden für jedes Design (20 nM) und lucKey (20 nM) in Gegenwart oder Abwesenheit des BoNT/B-Proteins (200 nM) durchgeführt. Die Lumineszenzwerte für jedes Design wurden in Abwesenheit von BoNT/B auf 100 normalisiert. Design 349_2S wurde aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit und Stabilität als bester Kandidat ausgewählt und erhielt den Namen lucCageBot. c, Bestimmung der lucCageBot-Empfindlichkeit. Die Biolumineszenz wurde über 6.000 s in Gegenwart von seriell verdünntem BoNT/B-Protein gemessen. Die Konzentrationen von lucCageBot:lucKey (in nM) betrugen 50:5, 5:5, 1:10 und 0,5:0,5 (von oben nach unten). d, LOD-Berechnungen für den Sensor bei verschiedenen Konzentrationen. Die Konzentrationen von lucCageBot:lucKey (in nM) betrugen 50:5, 5:5, 1:10 und 0,5:0,5 (von oben nach unten). Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, repräsentative Daten werden angezeigt und die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung

a, Strukturmodelle der Fc-Sensordesigns, die die verschiedenen Einfädelpositionen der S. aureus-Protein-A-Domäne C (orange, PDB-Code 4WWI) auf dem Riegel von lucCage (blau) zeigen. Das SmBit-Peptid wird in der Goldbanddarstellung dargestellt. I328S und L345S weisen auf Mutationen hin, die zur Abstimmung der Latch-Cage-Schnittstelle eingeführt wurden, wie in Extended Data Abb. 4a. b, Experimentelles Screening von sechs De-novo-Fc-Domänensensoren. Lumineszenzmessungen wurden für jedes Design (20 nM) und lucKey (20 nM) in Gegenwart oder Abwesenheit von rekombinantem humanem IgG1-Fc (200 nM) durchgeführt. Die Lumineszenzwerte wurden in Abwesenheit von Fc auf 100 normalisiert. Design 351_2S wurde aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit als bester Kandidat ausgewählt und erhielt den Namen lucCageProA. Dieses Experiment wurde mit einzelnen Replikaten in zwei unabhängigen Fällen durchgeführt, repräsentative Daten werden gezeigt. c, Bestimmung der Empfindlichkeit von lucCageProA. Die Biolumineszenz wurde über 6.000 s in Gegenwart von seriell verdünntem Fc-Protein gemessen. Die lucCageBot:lucKey-Konzentrationen (in nM) betrugen 5:5 (oben), 1:10 (Mitte) und 0,5:0,5 (unten). d, LOD-Berechnungen für den Sensor bei verschiedenen Konzentrationen. Die lucCageBot:lucKey-Konzentrationen (in nM) betrugen 5:5 (oben), 1:10 (Mitte) und 0,5:0,5 (unten). e, Strukturmodelle der HER2-Sensordesigns, die die verschiedenen Einfädelpositionen des HER2-Affibody-Proteins (PDB-Code 3MZW, beige) auf der Verriegelung von lucCage (blau) zeigen, wie in a. Die schwarzen Kästchen zeigen eine Nahaufnahme der Schnittstelle des Käfigs (blau) und des HER2-Affikörpers (beige) im 354_2S-Design. f, Experimentelles Screening von sieben De-novo-HER2-Sensoren. Lumineszenzmessungen wurden für jedes Design (20 nM) und lucKey (20 nM) in Gegenwart oder Abwesenheit der Ektodomäne von HER2 (200 nM) durchgeführt. Die Lumineszenzwerte wurden in Abwesenheit der HER2-Ektodomäne auf 100 normalisiert. Dieses Experiment wurde mit einzelnen Replikaten in zwei unabhängigen Fällen durchgeführt, repräsentative Daten werden gezeigt. Design 354_2S wurde aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit und Stabilität als bester Kandidat ausgewählt und erhielt den Namen lucCageHER2. g, Bestimmung der Empfindlichkeit von lucCagerHER2. Die Biolumineszenz wurde über 6.000 s in Gegenwart von seriell verdünntem HER2-Ektodomänenprotein gemessen. Die lucCageBot:lucKey-Konzentrationen (in nM) betrugen 5:5 (oben), 1:10 (unten) und 0,5:0,5 (unten). h, LOD-Berechnungen für den Sensor bei verschiedenen Konzentrationen. Die lucCageBot:lucKey-Konzentrationen (in nM) betrugen 5:5 (oben), 1:10 (Mitte) und 0,5:0,5 (unten). Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, sofern nicht ausdrücklich angegeben. Es werden repräsentative Daten angezeigt und die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung

a, Experimentelles Screening entworfener Sensoren für cTnI. Fragmente von cTnT, nämlich cTnTf1-f6, wurden rechnerisch an verschiedenen Positionen des Riegels in lucCage eingepfropft. Alle Designs wurden in E. coli hergestellt und experimentell bei 20 nM und 20 nM lucKey auf einen Anstieg der Lumineszenz in Gegenwart von 100 nM cTnI untersucht. Die Lumineszenzwerte wurden in Abwesenheit von cTnI auf 100 normalisiert. Dieses Experiment wurde mit einzelnen Replikaten in zwei unabhängigen Fällen durchgeführt, repräsentative Daten werden gezeigt. Das Design 336-cTnTf6-K342A wurde aufgrund seiner Empfindlichkeit, Änderung der Aktivierungsfalte und Stabilität als bester Kandidat (mit dem Namen lucCageTrop627) ausgewählt. b, Modelle von lucCageTrop627 und lucCageTrop – eine verbesserte Version, hergestellt durch Fusion von cTnC am C-Terminus von lucCageTrop627. Die Modelle werden in Banddarstellung dargestellt und bestehen aus SmBit (Gold), einem Fragment von cTnT (Cyan) (PDB-Code 4Y99), und cTnC (Grün) (PDB-Code 4Y99). Die schwarze Box zeigt eine Nahaufnahme der Schnittstelle zwischen Käfig (blau) und cTnT (cyan) im lucCageTrop-Design. c, Die Bindungsaffinität von lucCageTrop627 und lucCageTrop zu cTnI wurde durch Bioschichtinterferometrie gemessen. lucCageTrop zeigte eine siebenfach höhere Affinität zu cTnI als lucCageTrop627. d, Vergleich der Biolumineszenzkinetik zwischen lucCageTrop627 (oben) und lucCageTrop (unten) in Gegenwart von seriell verdünntem cTnI. Eine höhere Bindungsaffinität führt zu einem verbesserten Dynamikbereich und einer verbesserten Empfindlichkeit des Sensors. e, Bestimmung der Empfindlichkeit von lucCageTrop. Die Biolumineszenz wurde über 6.000 s in Gegenwart von seriell verdünntem cTnI gemessen. Die lucCageTrop:lucKey-Konzentrationen (in nM) betrugen 1:10, 1:1, 0,5:0,5 und 0,1:0,1 (von oben nach unten). f, LOD-Berechnungen für den Sensor bei verschiedenen Konzentrationen. Die lucCageTrop:lucKey-Konzentrationen (in nM) betrugen 1:10, 1:1, 0,5:0,5 und 0,1:0,1 (von oben nach unten). Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Es werden repräsentative Daten angezeigt und die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung

a, Die energieminimierten Modelle von lucCage-Designs werden mit den Gewindesegmenten von SmBiT (Gold) und dem Antigenmotiv von preS1 (Magenta) gezeigt. Das rechte Feld zeigt eine Nahaufnahme der Käfig-Motiv-Grenzfläche des HBV344-Designs. b, Experimentelles Screening aller Designs durch Überwachung der Lumineszenz jedes lucCage (20 nM) und lucKey (20 nM) in Gegenwart oder Abwesenheit des Anti-HBV-Antikörpers HzKR127-3.2 (100 nM). Die Lumineszenzwerte wurden in Abwesenheit von Anti-HBV auf 100 normalisiert. Dieses Experiment wurde in zwei unabhängigen Fällen doppelt durchgeführt und repräsentative Daten werden angezeigt. Das Design HBV344 wurde aufgrund seiner besseren Leistung ausgewählt und erhielt den Namen lucCageHBV. c, d, Bestimmung der lucCageHBV-Empfindlichkeit. Die Biolumineszenz wurde über 6.000 s in Gegenwart von seriell verdünntem HzKR127-3.2 gemessen. Die lucCageHBV:lucKey-Konzentrationen betrugen 5:5 nM (oben) und 1:1 nM (unten). Die Maximalwerte der Kurven in d werden verwendet, um die Kurven in c zu erhalten. e, LOD-Berechnungen für den Sensor bei verschiedenen Konzentrationen. Die lucCageHBV:lucKey-Konzentrationen betrugen 5:5 nM (oben) und 1:1 nM (unten). f, Nachweis von preS1 durch Konkurrenz von lucCageHBV344 und HzKR127-3.2, dargestellt in Abb. 3f. Lumineszenzkinetik nach Zugabe des Antikörpers (Anti-HBV, erster Pfeil). Die Anti-HBV-Antikörperkonzentrationen betrugen 50 nM (oben) und 12,5 nM (unten). Bei 6.000 s wurden unterschiedliche Konzentrationen der preS1-Domäne in die Vertiefungen injiziert (zweiter Pfeil) und die verringerten Lumineszenzsignale wurden zum Nachweis von preS1 verwendet. g, Design von lucCageHBVα für einen verbesserten Nachweis eines Anti-HBV-Antikörpers. Das Strukturmodell von lucCageHBVα wird mit einer Nahaufnahme der vorhergesagten Schnittstelle zwischen dem preS1-Epitop (magenta) und lucCage (blau) gezeigt. Das Design umfasst zwei Kopien des Epitops preS1 (Aminosäuren 35–46), die durch einen flexiblen Linker (grau) voneinander getrennt sind, um eine bivalente Interaktion mit dem Antikörper zu ermöglichen. Das SmBit-Peptid ist in Gold dargestellt. h, Bestimmung der Nachweisempfindlichkeit von lucCageHBVα gegenüber dem Vorhandensein des Antikörpers HzKR127-3.2 (Anti-HBV). Die Biolumineszenz wurde über 6.000 s in Gegenwart von seriell verdünntem HzKR127-3.2 gemessen. Die lucCageHBVα:lucKey-Konzentrationen (in nM) betrugen 1:10 (oben) und 0,5:0,5 (unten). i: Der lineare Bereich einer Kalibrierungskurve wurde verwendet, um den LOD des Antikörpernachweises zu bestimmen. j, Biolumineszenzbilder, aufgenommen mit einem BioRad ChemiDoc-Bildgebungssystem. Die lucCageHBVα:lucKey-Konzentrationen (in nM) betragen 50:5 (oben), 5:5 (Mitte) und 1:10 (unten). Veränderungen der Biolumineszenzwerte wurden als Funktion der Konzentration von HzKR127-3.2 festgestellt. Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, sofern nicht ausdrücklich angegeben, und repräsentative Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung

a, b, Experimentelles Screening von De-novo-Sensoren auf Antikörper gegen das SARS-CoV-2-Membranprotein (a) und das Nukleokapsidprotein (b). Ausgewählte Epitope des Membranproteins (M1, M3 und M4) und des Nukleokapsidproteins (N6 und N62) wurden rechnerisch an verschiedenen Positionen des Riegels in lucCage gepfropft. Jedes Design umfasste zwei Tandemkopien jedes Epitops, getrennt durch einen flexiblen Linker, um die bivalente Bindung von Antikörpern zu nutzen. Alle Designs wurden experimentell auf einen Anstieg der Lumineszenz bei 20 nM jedes lucCage-Designs und 20 nM lucKey in Gegenwart von polyklonalen Anti-M-Kaninchen-Antikörpern (a) oder monoklonalen Anti-N-Maus-Antikörpern bei 100 nM (Klon 18F629.1) untersucht ) (B). Diese Experimente wurden in zwei unabhängigen Fällen in zweifacher Ausführung (a) oder in Einzelwiederholungen (b) durchgeführt und es werden repräsentative Daten angezeigt. In Abwesenheit von Antikörpern wurden die Lumineszenzwerte auf 100 normalisiert. Die Designs M3_1-17_334 und N62_369-382_340 wurden aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit und Stabilität als die besten Kandidaten ausgewählt und erhielten die Namen lucCageSARS2-M bzw. ucCageSARS2-N. c, links, Strukturmodell von lucCageSARS2-M, das eine Nahaufnahme der vorhergesagten Schnittstelle zwischen dem M3-Epitop (rot) und lucCage (blau) zeigt. Mitte: Bestimmung der Empfindlichkeit von lucCageSARS2-M gegenüber polyklonalen Anti-M-Antikörpern. Die Biolumineszenz wurde über 4.000 s in Gegenwart von seriell verdünnten polyklonalen Anti-M-Antikörpern gemessen. Die lucCageSARS2-M:lucKey-Konzentrationen (in nM) betrugen 50:50 (oben) und 5:5 (unten). Rechts, LOD-Berechnungen für den Sensor bei verschiedenen Konzentrationen. d, links, Strukturmodell von lucCageSARS2-N, das eine Nahaufnahme der vorhergesagten Schnittstelle zwischen dem N62-Epitop (lila) und lucCage (blau) zeigt. Mitte: Bestimmung der Empfindlichkeit von lucCageSARS2-N gegenüber monoklonalen Anti-N-Antikörpern. Die Biolumineszenz wurde über 4.000 s für lucCageSARS2-N plus lucKey bei 50 nM in Gegenwart von seriell verdünntem Anti-N-Antikörper gemessen. Rechts, LOD-Berechnungen für den Sensor. Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, sofern nicht ausdrücklich angegeben. Es werden repräsentative Daten angezeigt und die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung

a, Experimentelles Screening von De-novo-Sensoren für die RBD des SARS-CoV-2-Spike-Proteins. Alle Designs wurden experimentell auf einen Anstieg der Lumineszenz bei 20 nM jedes lucCage-Designs und 20 nM lucKey in Gegenwart von 200 nM RBD untersucht. Die Lumineszenzwerte wurden in Abwesenheit von RBD auf 100 normalisiert. Dieses Experiment wurde in zwei unabhängigen Fällen doppelt durchgeführt und repräsentative Daten werden angezeigt. Design lucCageRBDdelta4_348 wurde aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit und Stabilität als bester Kandidat ausgewählt und erhielt den Namen lucCageRBD. b, Strukturmodell von lucCageRBD, bestehend aus dem LCB1-Binder (Magenta), der in LucCage (blau) gepfropft ist und ein Käfig-SmBiT-Fragment (Gold) umfasst. Die schwarzen Kästchen zeigen eine Nahaufnahme der Grenzfläche zwischen Käfig (blau) und dem LCB1-Binder (magenta) im lucCageRBD-Design. c, Bestimmung der Empfindlichkeit von lucCageRBD. Die Biolumineszenz wurde über 10.000 s in Gegenwart von seriell verdünntem RBD-Protein gemessen. Die Konzentrationen der lucCageRBD:lucKey-Konzentration (in nM) betrugen 1:1 (oben), 1:10 (Mitte) und 10:10 (unten). d, LOD-Berechnungen für den Sensor bei verschiedenen Konzentrationen. Die lucCageRBD:lucKey-Konzentrationen (in nM) betrugen 1:1 (oben), 1:10 (Mitte) und 10:10 (unten). e, Biolumineszenzbilder, die mit einem BioRad ChemiDoc-Bildgebungssystem aufgenommen wurden. Veränderungen der Biolumineszenzwerte wurden als Funktion der RBD-Konzentration mit 1 nM lucCageRBD und 10 nM lucKey festgestellt. f, Nachweis von RBD in 10 % simulierter Nasenmatrix. Links wurde die Biolumineszenz über die Zeit hinweg in Gegenwart von seriell verdünntem RBD-Protein gemessen. Richtig, die LOD wurde mit 12 pM berechnet. g, Nachweis von Spike-Protein in einem 20 % verdünnten gepoolten Serum. Links wurde die Biolumineszenz über einen längeren Zeitraum in Gegenwart von seriell verdünntem HexaPro-Spike-Protein gemessen. Richtig, die LOD wurde mit 47 pM berechnet. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Experimente in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Die repräsentativen Daten sind angegeben und die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung

a, b, Experimentelle Bewertung der Wirkung der lucKey-Länge (KCK) auf den dynamischen Bereich (DR) von lucCageRBD zum Nachweis von monomerem SARS-CoV-2 RBD. Ein verkürzter lucKey (kurzer lucKey), 14 Reste kürzer als der Schlüssel voller Länge an seinem C-Terminus (b), bietet aufgrund des reduzierten Hintergrundsignals einen besseren Dynamikbereich als der lucKey voller Länge (a), wie durch die Simulation in vorhergesagt Erweiterte Daten Abb. 1f, wobei die LOD gleich bleibt. c, Die Auswirkung der lucKey-Konzentration auf den Dynamikbereich. Eine Verringerung der lucKey-Konzentration erhöht den dynamischen Bereich von lucCageRBD aufgrund eines verringerten Hintergrundsignals, aber auch eines damit einhergehenden verringerten maximalen Biolumineszenzsignals. d, e, lucCageRBD (1 nM) wurde mit 20 nM RBD (d) oder 20 nM Spike-Protein (e) inkubiert, was voraussichtlich zu einer vollständigen Wiederherstellung der Luciferase-Aktivität führt. In Gegenwart von Spike-Protein war derselbe Sensor nicht in der Lage, das maximale Biolumineszenzsignal zu liefern, was auf die Wirkung von Faktoren schließen lässt, die in den Simulationen nicht erfasst wurden, wie z. B. sterische Hinderung gegen eine vollständige Luciferase-Rekonstitution. f, lucCageHBVα (1 nM), inkubiert mit 50 nM des HBV-Antikörpers HzKR127-3.2, zeigt eine fast vollständige Aktivierung, aber ein hohes Hintergrundsignal. g, lucCageTrop (1 nM) zeigt ein nicht ideales Hintergrundsignal und eine mäßige zielgesteuerte Aktivierung in Gegenwart von 20 nM cTnI. Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, repräsentative Daten werden angezeigt und die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung

a, Die biolumineszenten Emissionsspektren von lucCageRBD (links) als Reaktion auf variierende RBD-Konzentrationen. Antares2 ist ein effizientes CyOFP1-teLuc-CyOFP1 BRET-System40 mit einer Spitzenemission bei 590 nm (Mitte). Die Emissionsspektren wurden von einer Mischung aus lucCageRBD und lucKey (beide bei 1 nM), Antares2 (0,1 nM) und RBD in unterschiedlichen Konzentrationen (rechts) aufgenommen. Durch die Erfassung des einzelnen Signals von 470/40-nm- und 590/35-nm-Kanälen wurden die intensiometrischen Antworten von lucCageRBD in ratiometrische Messwerte umgewandelt. b, Gleichungen zur Berechnung des spektral ungemischten Verhältnisses. Das Gesamtsignal vom 470/40-nm-Kanal (T470) ist die Summe der Signale vom lucCageRBD-Sensor (I470) und der Antares2-Referenz (R470), und das Gesamtsignal vom 590/35-nm-Kanal (T590) ist gleich aus dem Sensorsignal (I590) plus dem Referenzsignal (R590). Da lucCageRBD im 590/35-nm-Kanal eine vernachlässigbare Emission erzeugt, entspricht T590 ungefähr R590 (R590 >> I590). R470 ist R590 × f, eine vorgegebene Konstante für Antares2, und daher konnte das ungemischte Verhältnis (I470/R590) in Echtzeit während der Signalerfassung berechnet werden. Die Konstante f für Antares2 wurde konsistent zu 0,43 bestimmt, entweder durch Aufnahme der vollständigen Spektren oder anhand des Filtersatzes. c: Unterschiedliche Konzentrationen von RBD wurden in 50 %, 25 % oder 10 % gepooltes Serum oder in 20 % simulierte Nasenflüssigkeit gegeben. Die absoluten Biolumineszenzintensitäten und Emissionskinetiken unterschieden sich aufgrund der Matrixhemmwirkung und des Substratumsatzes zwischen den Matrizen53. Im Gegensatz dazu führte die Kalibrierung mit Antares2 zu stabilen ratiometrischen Signalen (I470/R590). d, Die Biolumineszenzintensität von lucCageRBD bei sättigender RBD-Konzentration (grüne Kurve) ist etwa 20-fach höher als der Hintergrundwert. Die Angabe des Rohverhältnisses (T470/T590) als Funktion der RBD-Konzentration beeinträchtigt den dynamischen Bereich des Sensors (schwarze Kurve) aufgrund einer bemerkenswerten Emission am 470/40-nm-Kanal (R470) von Antares2. Nach der Berechnung und Umrechnung des unvermischten Verhältnisses liegt der Dynamikbereich bei ratiometrischen Messwerten (magentafarbene Kurve) um das 20-fache über dem Hintergrundpegel. e: Der Nachweis von versetztem RBD in vier verschiedenen anonymisierten menschlichen Seren (50 %) zeigt, dass die Kalibrierung mit spektral aufgelöstem Antares2 als interner Referenz die Schwankungen der intensiometrischen Biolumineszenz in diesen Matrizen minimieren kann. Biolumineszenzsignale und SD wurden dreifach gemessen, und ein repräsentatives Signal wird für Emissionsspektren bzw. Emissionskinetiken gezeigt. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung

Diese Datei enthält die ergänzende Diskussion, ergänzende Methoden, ergänzende Referenzen, ergänzende Abbildung 1 und ergänzende Tabellen 1–6.

Nachdrucke und Genehmigungen

Quijano-Rubio, A., Yeh, HW., Park, J. et al. De-novo-Design modularer und abstimmbarer Proteinbiosensoren. Natur 591, 482–487 (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-021-03258-z

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Eingegangen: 13. Juni 2020

Angenommen: 19. Januar 2021

Veröffentlicht: 27. Januar 2021

Ausgabedatum: 18. März 2021

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-021-03258-z

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