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Sep 29, 2023

Ein humanisiertes Minischweinmodell für die toxikologische Prüfung therapeutischer rekombinanter Antikörper

Naturbiomedizinische Technik

Nature Biomedical Engineering Band 6, Seiten 1248–1256 (2022)Diesen Artikel zitieren

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Die Sicherheit der meisten menschlichen rekombinanten Proteine ​​kann an transgenen Mäusen bewertet werden, die gegenüber bestimmten menschlichen Proteinen tolerant sind. Aufgrund unzureichender genetischer Vielfalt und grundlegender Unterschiede in den Immunmechanismen sind Kleintiermodelle menschlicher Krankheiten jedoch häufig ungeeignet für Immunogenitätstests und die Vorhersage unerwünschter Folgen bei menschlichen Patienten. Die meisten menschlichen therapeutischen Antikörper lösen bei Wildtyp-Tieren xenogene Reaktionen und damit eine schnelle Clearance der Arzneimittel aus, was die toxikologische In-vivo-Prüfung menschlicher Antikörper zu einer Herausforderung macht. Hier berichten wir über die Generation der Göttinger Minischweine, die ein Mini-Repertoire menschlicher Gene für die schweren Immunglobulinketten γ1 und γ4 und die leichte Immunglobulinkette κ tragen. Im Einklang mit Beobachtungen bei menschlichen Patienten tolerierten die genetisch veränderten Minischweine die klinisch nicht immunogenen monoklonalen IgG1κ-Isotyp-Antikörper Daratumumab und Bevacizumab und lösten Antikörper gegen den Checkpoint-Inhibitor Atezolizumab und das manipulierte Interleukin Cergutuzumab Amunaleukin aus. Die humanisierten Minischweine können die Sicherheits- und Wirksamkeitsprüfung therapeutischer Antikörper erleichtern.

Die Wirksamkeit und Sicherheit monoklonaler Antikörper (mAbs) kann beeinträchtigt werden, wenn die Verabreichung einer Verbindung beim Menschen eine Immunantwort hervorruft, die sich in der Entwicklung von Anti-Arzneimittel-Antikörpern (ADAs) äußert. Mehrere Faktoren können ADAs auslösen und werden als mit dem Patienten, der Krankheit, dem Produkt oder der Behandlung zusammenhängend klassifiziert. Sie können zu leichten bis lebensbedrohlichen Symptomen führen, die für mehrere klinisch zugelassene therapeutische Proteine ​​gut dokumentiert sind1. Diese Nebenwirkungen variieren je nach Verbindung und sind schwer vorherzusagen. Es bestehen immer noch große Lücken im Verständnis der Pharmakokinetik von ADAs, ihrer Neutralisierungsfähigkeit und ihrer Kreuzreaktivität mit endogenen Molekülen oder anderen biologischen Verbindungen.

Um diese Nachteile zu beheben, wurden verschiedene präklinische In-silico- und In-vitro-Modelle entwickelt2,3,4,5,6,7. Die Beurteilung der Immunogenität in In-vivo-Modellen umfasst Tierversuche im Kontext eines intakten Immunsystems. Aufgrund der Artenunterschiede wird jedoch jedes menschliche Protein bei einem Versuchstier wahrscheinlich eine Immunantwort hervorrufen. Dies kann umgangen werden, indem für die Tierart spezifische Ersatzantikörper verwendet werden (deren Vorhersagewert jedoch in Frage gestellt werden kann) oder transgene Tiere verwendet werden, die das menschliche Protein exprimieren und es daher als „selbst“ erkennen. Jede ausgelöste Immunantwort ist daher auf den veränderten Zustand des rekombinanten Proteins zurückzuführen. Um die Erzeugung separater transgener Tierlinien für einzelne therapeutische Proteine ​​zu vermeiden, haben einige Forschungsgruppen, darunter auch unsere, transgene Mäuse erzeugt, die Sätze menschlicher Immunglobulin-Gene exprimieren8,9,10. Im Gegensatz zu den meisten mit Antikörpern (Ab) humanisierten Mausmodellen zur Ab-Entdeckung exprimieren unsere transgenen Tiere immer noch ihre endogenen Immunglobulin-Gene (Ig) und sind somit vollständig immunkompetent. Die Funktion der menschlichen Ig-Transgene besteht ausschließlich darin, Toleranz zu induzieren, und sie müssen nicht unbedingt an einer Immunantwort beteiligt sein. Daher tragen die von uns etablierten Mauslinien ein menschliches IgG1-Minirepertoire, das nur aus der sekretierten Form der schweren menschlichen Ig-γ1- sowie der leichten Ig-κ- und Ig-λ-Ketten besteht. Die einbezogenen Gene sind diejenigen, die am häufigsten beim Menschen sowie bei der Produktion therapeutischer Antikörper verwendet werden11. Diese transgenen Mäuse ermöglichen Immunogenitätsstudien für eine ganze Kategorie menschlicher therapeutischer Antikörper und die Bewertung potenziell immunogener Modifikationen in Ab-Präparaten10. Aus offensichtlichen Gründen der Anatomie und der Lebensspanne sind die an Mäusen gewonnenen Daten im Hinblick auf Anwendungswege, Pharmakokinetik und langfristige toxikologische Bewertungen jedoch nicht immer direkt auf den Menschen übertragbar12. Der Internationale Rat zur Harmonisierung (ICH) der technischen Anforderungen für die Registrierung von Arzneimitteln für den menschlichen Gebrauch verlangt präklinische Sicherheitstests an einer Nagetierart und einer Nicht-Nagetierart. Bei therapeutischen Antikörpern sind nichtmenschliche Primaten (NHPs) oft die einzige Option. Die Verfügbarkeit eines universellen Nicht-Nagetier-Nicht-NHP-Modells zur Bewertung möglicher immunogener und immuntoxischer Eigenschaften menschlicher rekombinanter Abs wäre ein wertvolles Instrument. Dies würde die präklinische Sicherheit für diesen schnell wachsenden Markt verbessern.

Das Schwein hat viele Vorteile für präklinische Studien, da es in seiner Größe, in der Anatomie vieler Organsysteme und in seinen physiologischen und pathophysiologischen Reaktionen dem Menschen ähnelt. Schweine haben eine relativ kurze Tragzeit, große Wurfgrößen, eine schnelle Reifung und eine einfache Unterbringung unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen. Wichtig ist, dass die immunologischen Ähnlichkeiten zum Menschen das Schwein zu einem idealen Modell für die präklinische Forschung machen13,14,15. Wie bei Mäusen sind auch bei Schweinen gentechnische Methoden mittlerweile etabliert.

Auf der Grundlage der bisherigen Mausergebnisse10 wurden transgene Göttinger Minischweine erzeugt, die ein ähnliches Repertoire an menschlichen Ig-Schwerkettengenen (IGH) und Ig-κ-Leichtkettengenen (IGK) tragen. Der Grundriss des Projekts ist in Abb. 1a dargestellt. Es wurden zwei Expressionsvektoren generiert. Das erste Konstrukt umfasst nicht neu angeordnete Keimbahn-IGH-Gensegmente, die 5 variable (V), 5 Diversitäts- (D) und 6 verbindende (J) Elemente in Kombination mit der erforderlichen Sequenz zum Antreiben der Produktion von sekretorischen menschlichen IgG1 (hIgG1)-H-Ketten kodieren. Um zu beurteilen, ob nicht nur hIgG1, sondern auch der hIgG4-Isotyp exprimiert werden kann, wurden auch die konstante γ4 (Cγ4)-Region und entsprechende Schaltersequenzen (Sμ, Iγ-Sγ) in dieses Konstrukt einbezogen (Abb. 1b, IGH-γ1-γ4; NCBI-Zugangsnummer: OL809665). Humanes IgG1 und hIgG4 wurden ausgewählt, da dies die beiden Ig-Isotypen sind, die am häufigsten in humanen therapeutischen mAbs verwendet werden16. Das IGH-γ1-γ4-Konstrukt sollte einen Ig-Isotypwechsel von Cγ1 zu Cγ4 ermöglichen. Das zweite Konstrukt enthält IGK-Gensegmente, die für 2V- und 5J-Elemente kodieren, sowie die Sequenz, die für die Region der κ-Konstante (C) kodiert (Abb. 1c, IGK; NCBI-Zugangsnummer: OL809666). Bei richtiger Umlagerung sollten diese Genelemente ein Repertoire menschlicher löslicher IgG-Proteine ​​erzeugen, ohne den Prozess der Umlagerung und Repertoirebildung endogener Schweine-Ig-Proteine ​​zu beeinträchtigen, da dies die Expression des membrangebundenen menschlichen Ig erfordert, das nicht in dieser enthalten ist transgenes Konstrukt (siehe Abb. 1b). Alle in den Konstrukten verwendeten V-Gene wurden auf der Grundlage ihrer überwiegenden Verwendung im menschlichen peripheren Blut11 ausgewählt und zeigten im transgenen Mausmodell, dass sie eine breite Toleranz gegenüber menschlichen IgG1-Abs10 bieten.

a, Ein Überblick über das Projekt, das die Erzeugung und Anwendung von humanen IgG-transgenen Minischweinen zeigt. b, die sekretierte Form der schweren Immunglobulinkette (IGH-γ1-γ4) und c, die leichte κ-Kette (IGK). Abbildung erstellt mit BioRender.com.

Aus männlichen Göttinger Minischweinen isolierte Nierenfibroblasten wurden mit den Expressionsvektoren IGH-γ1-γ4 (31,4 kb) und IGK (10,9 kb) und einem selektierbaren Markergen (Phosphoglyceratkinase (PGK)-gesteuertes Blasticidin, BS; 1,05 kb) co-transfiziert. . Einzelzellklone wurden isoliert und mittels PCR auf das Vorhandensein aller drei Transgene untersucht. Vier bis fünf Zellklone wurden gepoolt und für den somatischen Zellkerntransfer verwendet, was zur Geburt von acht lebend geborenen männlichen Göttinger Ferkeln führte. Alle waren positiv auf das Vorhandensein der drei Transgene (nicht gezeigt). Vier Gründertiere erreichten die Geschlechtsreife (TG1–TG4). Alle vier trugen zwei Kopien des menschlichen IGH-γ1-γ4- und IGK-Transgens, wie durch Tröpfchen-PCR bestimmt, unterschieden sich jedoch in der Kopienzahl für das selektierbare Markergen (TG1–TG3, 1 Kopie; TG4, 3 Kopien). Mit Ausnahme von TG4 exprimierten alle Gründertiere die schwere (HC) und leichte (LC) Kette des menschlichen IgG (Abb. 2). Folglich wurden für die weitere Zucht nur TG1–TG3 verwendet. Alle Nachkommen (F1–F3) zeigten eine Vererbung von Mendelschen Transgenen, was auf eine Insertion an einem einzelnen genomischen Ort hinweist, und Gründer und Nachkommen zeigten ähnliche Mengen an menschlichem IgG im Serum (Abb. 2a, b) und einen reproduzierbaren Phänotyp (Abb. 3 und 4). . Im Gegensatz zu transgenen Mäusen mit menschlichem IgG110 wurden in den transgenen Minischweinen keine hybriden (Mensch/Schwein) IgG1-Moleküle nachgewiesen. Ein Doppelantikörper-Sandwich-ELISA, der das menschliche Igκ LC einfängt und menschliches Ig HC nachweist, zeigte die Expression von vollständig menschlichem IgG (Erweiterte Daten, Abb. 1).

a: Western-Blot, der die Expression der IgG-schweren γ1- (IgH-γ1) und κ-leichten (IgL-κ) Proteine ​​im Serum zeigt, das aus den transgenen Gründer-IgG-Minischweinen (TG1–-TG3) und F1-Tieren aus den Linien TG2 und TG3 isoliert wurde. WT Göttingen-Minischweine waren negativ für das Vorhandensein beider Proteine. Als Positiv- bzw. Negativkontrolle wurden menschliches IgG-Protein und PBS verwendet. Unverarbeitete Bilder aller Western Blots sind in den ergänzenden Daten 1 dargestellt. b, Das Vorhandensein von menschlichem IgG1-Protein wurde durch ELISA-Analyse in Serum bestätigt, das aus F1-Minischweinen isoliert wurde, die alle 3 Linien repräsentieren (TG-Linie 1, n = 5; TG-Linie 2, n = 4; TG-Zeile 3, n = 3). Bei WT-Tieren wurde kein menschliches IgG1 nachgewiesen (n = 4). Der horizontale Balken stellt den Median dar. Jeder Datenpunkt stellt ein biologisches Replikat dar. c: Gene der schweren und κ-Leichtkette des menschlichen IgG unterliegen funktionellen Genumlagerungen. Dargestellt ist eine Auswahl von Umlagerungen aller vier VH- und der beiden Vκ-Transgene. Umlagerungen menschlicher VH- und VΚ-Gene zeigen N-Nukleotid-Additionen. Die humane IgG4-Sequenz der Isotyp-Switch-Varianten ist braun dargestellt. Die J-Elemente in den neu angeordneten V-Genen sind in Klammern angegeben, identifizierte D-Genelemente sind unterstrichen und rechts angegeben.

Quelldaten

a: Menschliche IgG-transgene Minischweine (n = 2) zeigen nach einmaliger Immunisierung mit KLH in Alaun-Adjuvans Schweine-IgG-Anti-KLH-Antikörperreaktionen in vergleichbarem Ausmaß wie WT-Tiere (n = 2). b: Humane IgG-transgene Minischweine (n = 2) können nach erneuter Belastung mit KLH am Tag 35 Gedächtnisreaktionen auslösen (Pfeil). Die gepunktete rote Linie zeigt einen willkürlichen Schwellenwert bei einem Titer von 200 an. Statistische Analyse durch 2-Wege-Varianzanalyse (ANOVA); NS, nicht signifikant. Der horizontale Balken stellt den Median dar. Jeder Datenpunkt stellt ein biologisches Replikat dar.

Quelldaten

a, Schematischer Überblick über die Immunisierungsstrategie ohne Adjuvans. Vor jeder Behandlung werden Blutproben für die ADA-Analyse entnommen. b: Schweine-IgG-Anti-Bevacizumab-Antikörpertiter nach Immunisierung von 6 hIgG-transgenen (TG) Gründer-Minischweinen und 6 WT-Kontrollen mit Bevacizumab. Zusammengefasste Daten aus 3 Einzelstudien mit jeweils 2 transgenen und 2 WT-Minischweinen. c, Schweine-IgG-Anti-Bevacizumab-Antikörpertiter nach Immunisierung von 4 hIgG-transgenen Minischweinen der F1-Generation und 4 WT-Tieren mit Bevacizumab. d, OD von Schweine-IgG-Anti-Daratumumab-Antikörpern, gemessen mittels ELISA bei Minischweinen (TG, n = 4; WT, n = 4), die mit Daratumumab immunisiert wurden. Die gepunktete rote Linie zeigt einen willkürlichen Schwellenwert bei einem Titer von 200 oder einen Mittelwert + 6×SD-Schwellenwert im Fall von OD an. Statistische Analyse durch 2-Wege-ANOVA. Der horizontale Balken stellt den Median dar. Jeder Datenpunkt stellt ein biologisches Replikat dar.

Quelldaten

Um die Umlagerung der menschlichen V-Gensegmente in Schweine-B-Lymphozyten zu charakterisieren, wurden Messenger-RNA-Proben (mRNA-Proben) aus dem peripheren Blut eines transgenen Minischweins isoliert. Die Sequenzanalyse bestätigte funktionelle V(D)J-Umlagerungen menschlicher variabler schwerer (VH) und kappa leichter (VK) Gensegmente sowie N-Nukleotid-Additionen für die schwere und leichte Kette. Letzteres weist auf eine zeitlich koordinierte Umordnung der Gene der schweren und leichten Kette des Menschen während der Funktion der terminalen Desoxynukleotidyltransferase (TdT) des Schweins hin, die für die N-Nukleotid-Addition an der Verbindungsstelle der umgeordneten Immunglobuline verantwortlich ist. Dies wurde auch im analogen Mausmodell beobachtet10. Darüber hinaus enthielt die menschliche VH-Sequenz Aminosäureaustausche (siehe ergänzende Abbildung 1) aufgrund somatischer Mutationen außerhalb der komplementaritätsbestimmenden Regionen (Abb. 2c). Alle Versuche, IgG4-Protein im Serum von hIgG-transgenen Minischweinen nachzuweisen, waren erfolglos. Die RNA-Sequenzierungsanalyse ergab jedoch einen kleinen Anteil vertauschter IgG4-Gene (0,76 %; Abb. 2c und ergänzende Abb. 1). Dies beweist zwar, dass ein Wechsel des IgG-Isotyps stattfindet, ist jedoch ein seltenes Ereignis und erklärt, warum keine menschlichen IgG4-Proteine ​​nachgewiesen wurden. All dies deutet darauf hin, dass die Proteine ​​vom Schwein und vom Menschen kompatibel sind und die Neuordnung der menschlichen IgG-Gene in den transgenen Minischweinen effizient abläuft.

Die hIgG-Tiere sind gesund und leiden nicht unter einer erhöhten Infektionslast. Die Autopsie der Tiere zeigte ein normales Erscheinungsbild der Milz, der Lymphknoten und des Knochenmarks (Daten nicht gezeigt).

Die Immunkompetenz wurde auch experimentell unter Verwendung des T-Zell-abhängigen Modellantigens Keyhole Napfschnecken-Hämocyanin (KLH)16 bestätigt, dessen Reaktion für Göttinger Minischweine gut dokumentiert ist17. Zwei hIgG- und zwei Wildtyp-Minischweine (WT) wurden subkutan (sc) mit einer Einzeldosis von 20 mg kg-1 Körpergewicht KLH in Alaun-Adjuvans injiziert und die KLH-spezifische Antikörperreaktion wurde über 35 Tage verfolgt. Alle vier Minischweine zeigten eine Woche nach der Immunisierung eine IgM- (nicht gezeigt) und IgG-Reaktion, was bestätigt, dass die Transgenexpression die T-Zell-abhängigen Ab-Reaktionen auf dieses Protein nicht verändert (Abb. 3a). In einem anschließenden Auffrischungsexperiment folgte auf die erste KLH-Dosis eine erneute Belastung der Tiere mit einer zweiten Dosis am 35. Tag. Der schnelle Anstieg der KLH-spezifischen Schweine-IgG-Titer nach der Auffrischungsimpfung zeigt, dass die humanisierten Minischweine auch in der Lage sind, a zu vermehren Gedächtnisreaktion (Abb. 3b). Wie erwartet wurde kein KLH-spezifisches menschliches IgG nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Wie bereits bei hIgG1-transgenen Mäusen beobachtet10, beeinträchtigt die Expression von menschlichem IgG daher nicht die Immunkapazität von Göttinger Minischweinen.

Als nächstes beurteilten wir den Toleranzstatus der humanisierten Minischweine gegenüber prototypischen menschlichen therapeutischen Abs Bevacizumab und Daratumumab. Bei beiden handelt es sich um klassische Antikörper des menschlichen IgG1-Isotyps mit geringen Immunogenitätsraten (unter 1 %) bei Patienten1.

Transgenen und Wildtyp-Minischweinen mit humanem IgG wurde wiederholt Bevacizumab injiziert (0,4 mg kg Körpergewicht, 7 Injektionen; Abb. 4a). Wöchentlich wurden Serumproben gesammelt und Schweine-IgG-ADA mittels ELISA gemessen. Die Behandlung mit Bevacizumab führte zur Bildung von ADA bei Wildtyp-Minischweinen, jedoch nicht bei den hIgG-exprimierenden Gründer-Minischweinen (Abb. 4b) oder ihren F1-Nachkommen (Abb. 4c), was eine Immuntoleranz gegenüber menschlichem IgG1 demonstrierte und die Vererbung von Merkmalen bestätigte.

Die Behandlung mit Daratumumab führte weder bei transgenen noch bei Wildtyp-Tieren zu einem wesentlichen Anstieg der ADA-Titer. Die Rohdaten zeigten jedoch einen schwachen, aber spürbaren späten Anstieg der ADA-Signale bei den Wildtyp-Tieren, der in der Gruppe der transgenen Minischweine nicht zu finden war (Abb. 4d).

Alle Ergebnisse stimmen mit unseren früheren Ergebnissen von transgenen IgG-Mäusen überein, bei denen sich beide Abs ebenfalls als nicht immunogen erwiesen, während Wildtyp-Mäuse eine starke (Bevacizumab) oder mäßige (Daratumumab) ADA-Reaktion zeigten10 (Ergänzungstabelle 1).

Um das Potenzial dieses Modells zur Beurteilung der Immunogenität therapeutischer menschlicher Abs zu bestimmen, wurden Kohorten von vier hIgG- und WT-Minischweinen mit 0,4 mg/kg Körpergewicht Atezolizumab oder Cergutuzumab behandelt. Es ist bekannt, dass diese bei 39 % bzw. 70 % der Patienten ADA-Reaktionen auslösen18,19. Alle Minischweine entwickelten ADA-Reaktionen. Nach der Behandlung mit Cergutuzumab-Amunaleukin gab es keinen signifikanten Unterschied im ADA-Titer zwischen humanen IgG-transgenen Minischweinen und ihren Wildtyp-Wurfgeschwistern (Abb. 5a). Im Gegensatz dazu war der ADA-Titer bei den humanisierten Minischweinen nach der Behandlung mit Atezolizumab signifikant niedriger (P = 0,0075) (Abb. 5b), was den Unterschied in der Immunogenität zwischen diesen beiden therapeutischen Antikörpern widerspiegelt. Die Ergebnisse bei den humanen IgG-transgenen Minischweinen spiegeln die beim Menschen beobachteten Ergebnisse und Daten aus Studien an hIgG1-transgenen Mäusen20 wider.

a: Schweine-IgG-Anti-Cergutuzumab-Amunaleukin-Antikörper nach Immunisierung (TG-Minischweine, n = 4; WT-Minischweine, n = 4) mit Cergutuzumab-Amunaleukin. b: Schweine-IgG-Anti-Atezolizumab-Antikörper nach Immunisierung mit Atezolizumab. Die gepunktete rote Linie zeigt einen willkürlichen Schwellenwert bei einem Titer von 200 an. Statistische Analyse mittels 2-Wege-ANOVA. Der horizontale Balken stellt den Median dar. Jeder Datenpunkt stellt ein biologisches Replikat dar.

Quelldaten

Um die Vorhersagbarkeit pharmakologischer Studien zu gewährleisten, empfiehlt die ICH die Verwendung relevanter Tiermodelle. Längere toxikologische, pharmakokinetische und pharmakodynamische Studien mit rekombinanten Proteinen einschließlich therapeutischer Antikörper werden jedoch durch die Immunantwort des Tieres gegen die fremden Proteine ​​behindert. Um diese Probleme zu überwinden, wurden in den letzten Jahrzehnten die meisten menschlichen rekombinanten Proteine ​​in transgenen Mäusen evaluiert, die gegenüber dem spezifischen menschlichen Protein21 tolerant sind, und im Fall von Antikörpern in IgG-toleranten Mausmodellen8,9,10. Mehrere Faktoren haben jedoch ihre Anwendung für die Beurteilung der Immunogenität eingeschränkt. Dazu gehören der Mangel an genetischer Vielfalt und grundlegende Unterschiede in den Immunmechanismen zwischen Inzuchtmausstämmen22,23. Darüber hinaus schränkt die Größe von Mäusen ihre Verwendung zur Untersuchung der Immunogenität über bestimmte Anwendungswege, wie etwa die intravitreale Dosierung, ein. Aufgrund der Ähnlichkeit der Anatomie, Physiologie und Biochemie von Schweinen und Menschen wurden Schweine als geeignetes Nicht-Nagetier-Modell für präklinische Sicherheitstests vorgeschlagen. Die meisten Proteine, darunter auch die des Immunsystems, weisen strukturelle und funktionelle Ähnlichkeiten mit ihren menschlichen Gegenstücken auf. Im Vergleich zu Mäusen ähnelt das Immunsystem von Schweinen eher dem des Menschen24 und sie sind weniger durch Inzucht geprägt als Mäusestämme. Mehrere Linien von Minischweinen (Hanford, Yucatan, Yucatan micro, Sinclair und Göttingen) wurden entwickelt und werden häufig für die präklinische Sicherheitsbewertung verwendet25. Göttinger Minischweine verfügen über einen klar definierten genetischen Hintergrund und physiologische Parameter (hämatologische und klinisch-chemische Parameter, Hämodynamik), was sie zu einem idealen Modelltier macht. Es muss jedoch erwähnt werden, dass Schweine im Vergleich zu Nagetiermodellen höhere Kosten verursachen, da mehr Versuchsreagenzien, Tierpflege und Haltung erforderlich sind. Dennoch ermöglichen die Größe und Anatomie/Physiologie von Schweinen relevantere pharmakokinetische Studien und Verabreichungswege, wie z. B. intravitreale Injektion und Inhalation, die bei Mäusen schwer durchzuführen sind.

Wir haben ein gentechnisch verändertes Göttinger Minischweinmodell zur Verwendung in präklinischen Studien mit rekombinanten menschlichen Antikörpern beschrieben. Durch die Einführung eines Mini-Repertoires menschlicher IgG1- und IgG4-Gene in die Keimbahn von Schweinen haben wir Minischweine erzeugt, die gegenüber den meisten, wenn auch nicht allen, menschlichen rekombinanten Antikörpern tolerant sind.

Wir haben die erfolgreiche Neuanordnung der menschlichen IGH-γ1-γ4- und IGK-Keimbahngene und die Produktion von menschlichen IgG-Proteinen im Serum gezeigt. Der Einbau menschlicher Schaltersequenzen (Sμ, Ig-Sγ1) in das transgene Konstrukt führte zur Expression von IgG4-mRNAs, was auf eine ordnungsgemäße Verarbeitung durch die Schaltermaschinerie des Schweins hinweist. Die transgenen Minischweine übertrugen die neuen Merkmale stabil an ihre Nachkommen. Obwohl in geringen Mengen exprimiert, reichte die Menge an menschlichem IgG-Protein aus, um eine immunologische Toleranz gegenüber menschlichen IgG1-Abs zu induzieren und aufrechtzuerhalten.

Wir zeigten eine immunologische Toleranz gegenüber menschlichen Abs, indem wir vier therapeutische Abs verwendeten, die entweder eine klinische Immunogenität hervorrufen (Atezolizumab, Cergutuzumab-Amunaleukin) oder keine klinische Immunogenität aufweisen (Daratumumab, Bevacizumab). Wie erwartet induzierten Atezolizumab und Cergutuzumab-Amunaleukin ADA bei den hIgG-transgenen Minischweinen, Bevacizumab und Daratumumab jedoch nicht. Die Immunantwort gegen Bevacizumab war bei Wildtyp-Minischweinen stark, nach der Behandlung mit Daratumumab jedoch gering. Daratumumab ist eine zugelassene Immuntherapie für das multiple Myelom, die CD38-exprimierende Krebszellen abtötet26. Wir können eine verbleibende Bindung von Daratumumab an Schweine-CD38 und die anschließende Erschöpfung der ADA-sekretierenden Plasmazellen nicht ausschließen, was die schwache Immunantwort erklären könnte. Obwohl wir eine Toleranz gegenüber einer Vielzahl/Anzahl menschlicher IgG1-Antikörper gezeigt haben, sind weitere Experimente erforderlich, um die Toleranz gegenüber einem viel breiteren Spektrum menschlicher Antikörper zu beurteilen.

Es wird angenommen, dass der Grund für die ADA-Bildung als Reaktion auf Atezolizumab- und Cergutuzumab-Amunaleukin-Antikörper mit deren Wirkungsweise zusammenhängt. Die Interleukin-2 (IL-2)-Variante von Cergutuzumab Amunaleukin reagiert kreuzreagiert mit dem IL-2-Rezeptor von Menschen und Schweinen (auf der Grundlage von Sequenzhomologie und experimentellen Daten27), der bekanntermaßen eine wichtige Rolle bei Immunität und Toleranz spielt28 . Atezolizumab geht über 16 wichtige Aminosäurereste29, die bei Menschen, Mäusen und Schweinen hoch konserviert sind, engen Kontakt mit dem humanen programmierten Todesliganden 1 (PD-L1) ein. Auf der Grundlage der Kristallstruktur des humanen PD-L1/Atezolizumab-Komplexes29 haben wir ein strukturelles In-silico-Modell der PD-L1/Atezolizumab-Wechselwirkung zwischen Maus und Schwein erstellt, das stärkere Bindungseigenschaften für den Schweinekomplex im Vergleich zu denen bei Mäusen nahelegt (Ergänzung). Abb. 2). Aufgrund dieser Daten und der Tatsache, dass die Wechselwirkung von Atezolizumab mit Maus-PD-L1 experimentell bestätigt wurde30, kann eine ähnliche Kreuzreaktivität mit Schweine-PD-L1 angenommen werden. Der Mechanismus der Immunogenität könnte daher mit der Hemmung der PD1/PD-L1-Interaktion zusammenhängen, einem wichtigen Regulator der Selbsttoleranz31.

Es ist bekannt, dass die Pharmakologie therapeutischer Antikörper bei der Bindung an ihre Ziele ein wesentlicher Faktor für die Toxizität ist und das Immunogenitätsprofil beeinflusst32,33. Folglich würde ein Mangel an Kreuzreaktivität den Nutzen der transgenen hIgG-Tiermodelle einschränken. Da aktuelle Daten eine hohe Sequenzähnlichkeit zwischen den meisten menschlichen und Schweine-Antigenen zeigen, sollte dies kein Problem darstellen34,35,36, aber für jeden neuen getesteten Antikörper in Betracht gezogen werden.

Die Empfindlichkeit, mit der hIgG-transgene Minischweine auf immunogene Verbindungen reagieren und gleichzeitig nicht-immunogene Abs tolerieren, macht sie zu einem idealen Modell für Sicherheitsbewertungen therapeutischer Antikörper und die Vorhersage möglicher Nebenwirkungen.

Die ICH fordert, dass präklinische Sicherheitstests in prädiktiven Tiermodellen durchgeführt werden – einer Nagetierart und einer Nicht-Nagetierart. Die zuvor erzeugten Mauslinien und die neu gewonnenen humanisierten Minischweine erfüllen diese Anforderungen an humane rekombinante Antikörper und könnten daher Sicherheits- und Wirksamkeitstests ermöglichen und den Bedarf an Studien in NHPs reduzieren.

Die Genehmigung für die Erzeugung transgener Schweine und die Durchführung der Tierversuche wurde von der Regierung von Oberbayern erteilt (ROB-55.2-1-54-2532-6-13). Die Experimente wurden gemäß dem deutschen Tierschutzgesetz und der Norm der Europäischen Union für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt.

Zwei rekombinante DNA-Konstrukte, die die lösliche Form der schweren γ-Kette (IGH) und der leichten κ-Kette (IGK) von menschlichem Ig kodieren, wurden wie zuvor beschrieben10 erzeugt. Das IGH-γ1-γ4-Konstrukt (31,4 kb) umfasst eine 10,9 kb große Region, die fünf variable Regionen (VH 1–69, VH 4–59, VH 3–30, VH 3–23, VH 1–18) und fünf Diversitätsregionen enthält (DH3-3, DH 4-4, DH2-8, DH3-9, DH3-10), ein 8,5 kb großes Fragment, das die Verbindungselemente JH-1 bis JH-6 trägt, eine intronische Enhancer- und Switch-Region (Sμ) und a 9,1-kb-Fragment, das die Konstanten γ-1 (Exons 1–4) und γ-4 (Exons 1–4) enthält und die sekretierten IgG1- und IgG4-Isoformen kodiert. Alle Regionen wurden von endogenen Sequenzen des menschlichen IGH-Gens mit einer Länge zwischen 400 bp und 1,3 kb flankiert. Das IGK-Konstrukt (10,9 kb) umfasst ein 1,5 kb großes Fragment, das zwei variable Regionen (Vκ 3–20 und Vκ 1–17) enthält, ein 5,6 kb großes Fragment, das fünf Verbindungselemente Jκ-1 bis Jκ-5 enthält, eine C-Region und eine Maus Igκ 3'-Enhancer-Element (E). Alle Fragmente wurden von endogenen Sequenzen des menschlichen IGK-Gens mit einer Länge zwischen 500 bp und 1,7 kb flankiert.

Schweinenierenfibroblasten (PKFs) wurden mit der Standardmethode aus einem männlichen Göttinger Minischwein isoliert37. PKFs wurden mit DMEM mit hohem Glucosegehalt, ergänzt mit 10 % FBS (fötales Rinderserum), 2 mM NEAA (nicht essentielle Aminosäuren) und 2 mM L-Glutamin, kultiviert. Die Zellen wurden alle 3–5 Tage passagiert und in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 bei 50–90 % Konfluenz gehalten. Alle Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich bezogen.

Passierte 1–2 PKFs wurden mit den Expressionsvektoren IGH-γ1-γ4 (31,4 kb) und IGK (10,9 kb) und einem selektierbaren Markergen (PGK-gesteuertes Blasticidin, BS; 1,05 kb) in einer Konzentration elektroporiert (Eporator, Eppendorf). 13 μg, 4,5 μg bzw. 0,05 μg (Molverhältnis 10:10:1). Alle drei Transgene wurden für die Transfektion vorbereitet, indem das Plasmidrückgrat entfernt wurde. Die IGK- und IGH-γ1-γ4-Konstrukte wurden durch präparative Pulsfeldelektrophorese und Elektroelution und die BS-Expressionskassette durch Agarosegelelektrophorese unter Verwendung des Wizard-Kits (Sigma-Aldrich) gereinigt. Zur Transfektion wurden die Zellen 85 μs lang einem elektrischen Impuls von 1.200 V ausgesetzt und anschließend 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit 8 μg ml−1 BS selektiert. Einzelne stabile transfizierte Zellklone wurden isoliert, Proben jedes Klons in einem frühen Stadium kryokonserviert und Replikatproben für weitere Analysen kultiviert.

Für das PCR-Screening wurde aus einzelnen stabilen transfizierten Zellklonen isolierte DNA verwendet. Die folgenden Primer wurden verwendet, um das Vorhandensein des IGH-γ1-γ4-Transgens zu identifizieren: IGH_F und IGH_R zur Amplifikation des 1,4-kb-Fragments, IGK-Transgen: IGK_F und IGK_R zur Amplifikation des 1,26-kb-Fragments. Für BS-Transgen: BS_F- und BS_R-Primer wurden zur Amplifikation des 0,5-kb-Fragments verwendet. Die Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle 2 angegeben. Die PCR wurde unter Verwendung der GoTaq-Polymerase durchgeführt. Die Temperaturwechselparameter waren: 5 Min., 95 °C; dann 35 Zyklen von: 15 s, 95 °C; 30 s, 60 °C; 1 Minute, 72 °C; gefolgt von 5 Min., 72 °C.

Der Kerntransfer wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt38. Kurz gesagt wurden in vitro gereifte Eizellen entkernt und eine einzelne Spenderzelle in den perivitellinen Raum jeder Eizelle platziert. Nach der Fusion und Embryonenaktivierung wurden die rekonstituierten Embryonen in den Eileiter hormonell synchronisierter Jungsauen transferiert. Zwischen 80 und 120 rekonstruierte Embryonen wurden jedem Empfänger-Jungsau übertragen.

ddPCR wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt39. Die Kopienzahl des Transgens wurde unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Sonden bestimmt: IGH 5'FAM-ATGGGCACGACCGACCTGAGC-BHQ3' (Primer: dIGH_F und dhIGH_R); IGK 5´FAM-AGGGCTTCACAGATAGAGCTCATTTT-BHQ3´ (Primer: dIGK_F und dIGK_R). Als Referenz wurde die GAPDH-Sonde 5'HEX-TGTGATCAAGTCTGGTGCCC-BHQ3' (dGAPDH_F und ddGAPDH_R) verwendet. Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle 2 angegeben. Die Zielgene wurden unter Verwendung des QX100-Systems (BioRad Laboratories) quantifiziert.

Das Blut eines 1 Jahr alten (F3) männlichen menschlichen IgG-transgenen Minischweins wurde in K2EDTA-Röhrchen gesammelt und anschließend mit RNAlater gemischt und bei –80 °C gelagert. RNA aus Blut wurde mit dem RiboPure Blut-RNA-Reinigungskit (Invitrogen) extrahiert. Die RNA-Integritätszahl (RIN) betrug >9, bestimmt mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer. Die RNA wurde unter Verwendung von SuperScript IV VILO Master Mix (Invitrogen) mit 500 ng Gesamt-RNA als Input transkribiert. Anschließend wurden die rekombinierten menschlichen IgG-Transkripte durch PCR unter Verwendung eines Q5 High-Fidelity PCR-Kits (NEB) amplifiziert. Zunächst wurden sieben Vorwärtsprimer, die für verschiedene variable schwere und variable Kappa-Leichtkettensegmente spezifisch sind, in Kombination mit Rückwärtsprimern verwendet, die an gemeinsame konstante Schwer- und konstante Kappa-Leichtkettensequenzen binden. Als nächstes wurden die PCR-Produkte mit dem QIAquick PCR-Reinigungskit (Qiagen) gereinigt. Die PCR-Produkte aus den schweren Kettenreaktionen wurden als Vorlage für die Nested-PCR mit einem weiteren Satz von fünf Primerpaaren verwendet. Alle Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle 2 angegeben. Anschließend wurden Illumina-Sequenzierungsbibliotheken aus 10 pM jedes gereinigten PCR-Produkts unter Verwendung des TruSeq Nano DNA-Probenvorbereitungsprotokolls (Illumina) erstellt. Die Probenbibliotheken wurden in einem Illumina MiSeq-Lauf unter Verwendung von Paired-End-Sequenzierung für 2 × 300 Zyklen sequenziert.

Beide Partner überlappender Paired-End-Lesevorgänge wurden mit der Usearch-Toolversion 0.667_i86linux32 und den Parametern -fastq_pctid 75 und -fastq_maxdiffs 2540 zusammengeführt. Anschließend wurden die Lesevorgänge in Aminosäuresequenzen im erwarteten Rahmen übersetzt und auf das Vorhandensein von 5 erwarteten benachbarten Aminogruppen gefiltert Säuren und das Fehlen von Stoppcodons, um potenziell funktionelle Umlagerungen zu erreichen. Ergänzende Abbildung 1a zeigt die erhaltenen Lesezahlen.

MyOne Streptavidin T1 Dynabeads (Invitrogen) wurden gewaschen und entweder mit 4 μg biotinyliertem Maus-Anti-Human-IgG1 (Klon HP6069, Invitrogen) oder 5 μg biotinyliertem Maus-Anti-Human-Ig κ (Klon G20-193, BD) pro Probe gemäß Standard beschichtet Protokolle. Zur Immunpräzipitation wurden die beschichteten Perlen über Nacht bei 4 °C auf einem Rotator mit 100 µl Minischweinserum, 1:2 in PBS verdünnt, inkubiert. Nach anschließenden Waschschritten wurden die präzipitierten humanen IgG1- oder humanen Ig-κ-Antikörper durch 10-minütiges Erhitzen auf 95 °C mit 2x Laemmli-Probenpuffer (BioRad) eluiert und direkt auf Mini-PROTEAN TGX-Gele (4–20 %, BioRad) geladen. . Als Positivkontrolle diente Wildtyp-Minischweinserum, versetzt mit 100 ng menschlichem IgG1κ-Antikörper, und SeeBlue Plus2 (Invitrogen) diente zusammen mit MagicMark XP (Invitrogen) als Molekulargewichtsmarker. Nach der Trennung durch Elektrophorese wurden die Proben auf Nitrozellulosemembranen (iBlot, Invitrogen) übertragen. Nach der Blockierung mit 5 % Magermilchpulver in Tris-gepufferter Salzlösung-Tween (TBST) wurden die Membranen mit 1:5.000 Meerrettichperoxidase (HRP) Ziegen-Anti-Human-IgG H+L (polyklonal, Jackson) oder 1:10.000 HRP Maus sondiert Anti-Human-Ig κ (Klon EPR5367-8, Abcam) und unter Verwendung von SuperSignal West Femto-Substrat (Thermo Fisher) entwickelt.41,42

Zur Quantifizierung von Human-IgG wurden Nunc MaxiSorp ELISA-Platten (Invitrogen) mit 1 μg ml−1 Kaninchen-Anti-Human-IgG H+L (polyklonal, OriGene) in Beschichtungspuffer (0,1 M Natriumbicarbonat, pH 9,6, Alfa) beschichtet 4 °C über Nacht. Die Platten wurden dreimal mit PBS mit 0,05 % Tween-20 gewaschen, bevor sie 1 Stunde lang mit PBS mit 2 % BSA (Thermo Fisher) blockiert wurden. Reihenverdünnungen von Minischweinserumproben oder gereinigtem humanem IgG1k als Positivkontrolle wurden in PBS + 1 % FBS hergestellt und auf den gewaschenen ELISA-Platten 2,5 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem anschließenden Waschen wurde gebundenes menschliches IgG 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit HRP-Anti-Human-IgG (Klon G18-145, BD) sondiert, gewaschen und dann mit Ultra TMB-ELISA-Substrat (Thermo Fisher) entwickelt. Die Reaktion wurde nach 5 Minuten mit 0,18 M Schwefelsäure (Merck Millipore) gestoppt und die optische Dichte (OD) bei 450 nm mit dem VersaMax ELISA-Plattenlesegerät gemessen. Die OD-Werte von vier Standardkurven wurden interpoliert, um die Konzentration von menschlichem IgG1 im Serum zu berechnen.

Um das Vorhandensein vollständig menschlicher oder hybrider Schweine/Mensch-IgG-Proteine ​​nachzuweisen, wurde ein ELISA wie oben beschrieben mit den folgenden Antikörpern durchgeführt: (1) Beschichtung mit Ziegen-F(ab')2-Anti-Human-κ-Leichtkette (LC)-spezifischem Ab ( polyklonal, Sigma-Aldrich) und Nachweis mit einem HRP-markierten Anti-Human-IgG-Schwerketten-(HC)-Ab (Klon G18-145, BD) (zur Erkennung von Human-IgG); und (2) Beschichten mit Maus-Anti-Human-Ig-κ-LC-spezifischem Ab (Klon G20-361, BD) und Nachweis mit einem HRP-markierten Maus-Anti-Schwein-IgG-HC (Klon 1G5H7, ProSci) (zur Erkennung von Schweine-/Mensch-IgG). ).

Transgene menschliche IgG-Minischweine und WT-Göttingen-Minischweine beiderlei Geschlechts wurden nebeneinander mit sieben subkutanen Injektionen des in PBS verdünnten Antigens zweimal pro Woche immunisiert. Die Antigene wurden in folgenden Dosen verabreicht: KLH 20 mg kg−1; Bevacizumab, Daratumumab, Cergutuzumab, Amunaleukin und Atezolizumab 0,4 mg kg−1 Körpergewicht.

Blutproben wurden am Tag 0 (naiv) und in wöchentlichen Abständen für 4–5 Wochen vor den Injektionen entnommen. Das Blut wurde in Serum-Z-Gel-Röhrchen (Sarstedt) gesammelt, 30 Minuten bei Raumtemperatur gerinnen gelassen und anschließend zentrifugiert.

Zum Nachweis von ADA wurden ELISA-Platten mit 5 μg ml−1 des zur Immunisierung verwendeten Antigens oder Fragmenten davon wie oben beschrieben beschichtet. Seriell verdünnte Serumproben (1:50, dann 1:3 für insgesamt 8 Verdünnungen) wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und die Bindung von ADA wurde durch einstündige Inkubation mit dem alkalischen Phosphatase-gekoppelten AffiniPure Ziegen-Anti-Schweine-IgG nachgewiesen ( H+L) (polyklonaler, Jackson) Nachweisantikörper. Anschließend wurden die ELISA-Platten 10 Minuten lang mit p-Nitrophenylphosphat (Merck Millipore) entwickelt, bevor die OD bei 405 nm abgelesen wurde.

Für die Berechnung der ADA-IgG-Titer wurde für jede Studie ein Grenzwert auf der Grundlage der mittleren OD bei einer Verdünnung von 1:50 aller naiven Proben multipliziert mit ihrer 6-fachen Standardabweichung bestimmt. Es wurde festgestellt, dass die Baseline-Ausreißer über dem 1,5-fachen des Interquartilbereichs von Quartil 3 lagen, und ausgeschlossen. Die OD-Werte titrierter Serumproben wurden unter Verwendung des Polynoms 5. Grades angepasst und die Titer wurden durch den Schnittpunkt dieser Kurve mit dem ermittelten Schwellenwert bestimmt. Alle Titer über dem willkürlichen Schwellenwert von 200 werden als positiv gewertet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Papier und seinen Zusatzinformationen verfügbar. Die Quelldaten für die Zahlen sind diesem Dokument beigefügt. Die im Rahmen der Studie generierten Roh- und Analysedatensätze sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken L. Petersen und R. Moser für experimentelle Unterstützung, G. Steiner für Titerberechnungen und C. Klein und S. Klostermann für hilfreiche Beiträge zur Antikörper-Kreuzreaktivität. Darüber hinaus danken wir PJ Knuckles, A. Kiialainen und U. Nelböck-Hochstetter für die Initiierung der VDJ-Sequenzierung sowie A. Greiter-Wilke und EM Amen für die kontinuierliche tierärztliche und organisatorische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von F. Hoffmann-La Roche Ltd. finanziert.

Folgende Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Tatiana Flisikowska, Jerome Egli, Angelika Schnieke und Antonio Iglesias.

Abteilung für Molekulare Lebenswissenschaften, Lehrstuhl für Nutztierbiotechnologie, Fakultät für Lebenswissenschaften Weihenstephan, Technische Universität München, Freising, Deutschland

Tatiana Flisikowska, Krzysztof Flisikowski, Marlene Stumbaum & Angelika Schnieke

Roche Pharmaceutical Research and Early Development, Roche Innovation Center Basel, Basel, Schweiz

Jerome Egli, Erich Küng, Martin Ebeling, Roland Schmucki, Thomas Singer, Felix Weber & Antonio Iglesias

Roche Pharmaceutical Research and Early Development, Roche Innovation Center München, Penzberg, Deutschland

Guy Georges

Genzentrum und Fachbereich Veterinärwissenschaften, Molekulare Tierzucht und Biotechnologie, Ludwig-Maximilians-Universität München, München, Deutschland

Mayuko Kurome, Barbara Kessler, Valeri Sachartschenko & Eckhard Wolf

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AI, TS, AS und TF trugen zur Studienkonzeption und -gestaltung bei. JE, TF, AI und AS haben den Artikel geschrieben. TF, KF, MS, MK, BK, VZ, EW, JE und EK führten die Experimente durch. JE, TF, AS, AI, FW, ME, RS und GG analysierten und interpretierten die Daten. Alle Autoren gaben aktives und wertvolles Feedback zum Manuskript.

Korrespondenz mit Felix Weber oder Angelika Schnieke.

JE, EK, ME, RS, GG, TS, FW und AI sind Mitarbeiter von F. Hoffmann-La Roche Ltd. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Biomedical Engineering dankt John Hammond, Bernd Jilma und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Ein Doppelantikörper-Sandwich-ELISA wurde mit Serum durchgeführt, das aus transgenen Minischweinen F0 (n = 4), F1 (n = 4) und F2 (n = 4) isoliert wurde. Als Kontrollproben dienten Humanserum (Sigma-Aldrich) (1:100 verdünnt) und Wildtypserum (WT, n = 10). a, Das Vorhandensein von vollständig humanem IgG1-Protein (Beschichtung: Ziegen-Anti-Human-κ-Leichtketten-(LC)-Ab, Nachweis: HRP-markierter Anti-Human-IgG-Schwerketten-(HC)-Ab) in Serum, das aus transgenen Minischweinen isoliert wurde. b, ELISA zum Nachweis von hybridem Schweine-/Mensch-IgG (Beschichtung: Maus-Anti-Human-Ig-κ-LC-spezifischer Ab, Nachweis: Maus-Anti-Schwein-IgG-HC) zeigte eine gewisse Kreuzreaktivität mit Schweine-LC, was zu einem positiven Signal bei WT- und TG-Minischweinen führte. Ein Nachweis mit Maus-Anti-Schwein-IgG-HC erhöhte das Signal in transgenen Minischweinen jedoch nicht signifikant, was auf die Expression vollständig menschlicher IgG-Proteine ​​hinweist. Die statistische Analyse wurde mittels gewöhnlicher einseitiger Varianzanalyse (ANOVA) und dem Holm-Sidak-Mehrfachvergleichstest durchgeführt; p = P-Wert, ns = nicht signifikant, Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Jeder Datenpunkt stellt ein biologisches Replikat dar.

Quelldaten

Ergänzende Abbildungen und Tabellen.

Unbeschnittene Western Blots für Abb. 2a.

Quelldaten für Abb. 2a und 3–5 sowie für erweiterte Daten Abb. 1.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Flisikowska, T., Egli, J., Flisikowski, K. et al. Ein humanisiertes Minischweinmodell für die toxikologische Prüfung therapeutischer rekombinanter Antikörper. Nat. Biomed. Eng 6, 1248–1256 (2022). https://doi.org/10.1038/s41551-022-00921-2

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Eingegangen: 15. Juli 2021

Angenommen: 01. Juli 2022

Veröffentlicht: 22. September 2022

Ausgabedatum: November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-022-00921-2

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