Blog

Apr 30, 2023

Struktur und Mechanismus des Oxalattransporters OxlT in einem Oxalat

Band Nature Communications

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1730 (2023) Diesen Artikel zitieren

2494 Zugriffe

54 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Ein Oxalat abbauendes Bakterium in der Darmmikrobiota absorbiert aus der Nahrung gewonnenes Oxalat, um es als Kohlenstoff- und Energiequelle zu nutzen und so das Risiko der Bildung von Nierensteinen bei Wirtstieren zu verringern. Der bakterielle Oxalattransporter OxlT nimmt Oxalat selektiv aus dem Darm zu Bakterienzellen auf und unterscheidet ihn strikt von anderen Nährstoffcarboxylaten. Hier präsentieren wir Kristallstrukturen von Oxalat-gebundenem und ligandenfreiem OxlT in zwei unterschiedlichen Konformationen, verschlossenen und nach außen gerichteten Zuständen. Die Ligandenbindungstasche enthält basische Reste, die mit Oxalat Salzbrücken bilden und gleichzeitig den Konformationswechsel in den verschlossenen Zustand ohne saures Substrat verhindern. Die verschlossene Tasche kann Oxalat aufnehmen, jedoch keine größeren Dicarboxylate, wie z. B. Stoffwechselzwischenprodukte. Die Permeationswege aus der Tasche werden durch umfangreiche Wechselwirkungen zwischen Domänen vollständig blockiert, die allein durch das Umklappen einer einzelnen Seitenkette neben dem Substrat geöffnet werden können. Diese Studie zeigt die strukturellen Grundlagen metabolischer Wechselwirkungen, die eine günstige Symbiose ermöglichen.

Oxalat ist das kleinste Dicarboxylat (C2O42–), das über unsere tägliche Ernährung aus oxalathaltigen Lebensmitteln1 wie Gemüse, Bohnen und Nüssen2 aufgenommen wird. Oxalat ist auch ein Endprodukt des Stoffwechsels in unserem Körper und wird teilweise über den systemischen Kreislauf in den Darm ausgeschieden1. Anschließend wird es aus dem Darmtrakt aufgenommen und über die Niere ausgeschieden3. Überschüssiges Oxalat bildet jedoch mit Blutkalzium ein unlösliches Salz und verursacht Nierensteinerkrankungen (Abb. 1a). Oxalobacter formigenes ist ein Oxalat abbauendes Bakterium im Darm4, das intestinales Oxalat metabolisch abbauen kann und somit erheblich zur Oxalathomöostase in den Wirtstieren, einschließlich Menschen, beiträgt3,5,6. Tatsächlich ist bekannt, dass Patienten mit Mukoviszidose7 oder entzündlichen Darmerkrankungen8 oder Patienten, die sich einer Jejunoileal-Bypass-Operation9 unterzogen haben, eine geringe Kolonisierungsrate von O. formigenes und ein erhöhtes Risiko für Hyperoxalurie und Nierensteinbildung aufweisen.

a Schematische Darstellung der OxlT-Funktion im Oxalat abbauenden Bakterium O. formigenes im Darm. b, c Kristallstrukturen des oxalatgebundenen (PDB ID 8HPK; b) und ligandenfreien (PDB ID 8HPJ; c) OxlT. d Überlagerung von oxalatgebundenem und ligandenfreiem OxlT. Gezeigt werden eine Ansicht aus dem Periplasma (oben) und zwei Ansichten in der Transmembranebene (unten). e, f Karte des elektrostatischen Oberflächenpotentials von Oxalat-gebundenem (e) und ligandenfreiem (f) OxlT. Auf den Oberflächen wurden elektrostatische Potentiale bei ±5 kTe−1 abgebildet.

Der Oxalattransporter (OxlT), ein Oxalat:Formiat-Antiporter (OFA)10 in O. formigenes, ist ein Schlüsselmolekül für den Oxalatstoffwechsel in diesem Bakterium. OxlT katalysiert den Antiport von Carboxylaten durch die Zellmembran entsprechend ihrem elektrochemischen Gradienten mit einer für das C2-Dicarboxylat Oxalat optimierten Substratspezifität. Tatsächlich zeigt der Transporter eine hohe Umsatzrate (>1000/s) für den Oxalat-Selbstaustausch11,12. Unter physiologischen Bedingungen im Oxalat-Autotrophen O. formigenes ermöglicht die Carboxylat-Austauschfunktion von OxlT die Aufnahme von Oxalat aus dem Wirtsdarm als einzige Kohlenstoffquelle für das Bakterium und die Freisetzung von Formiat (HCO2–), dem endgültigen Abbauprodukt von Oxalat das giftig ist, wenn es sich in der Bakterienzelle ansammelt11,12,13 (Abb. 1a). Der katalytische OxIT-Umsatz des Oxalat:Formiat-Austauschs geht mit dem metabolischen Abbau von Oxalat zu Formiat über eine Decarboxylase einher, die ein Proton im Zytosol verbraucht und dadurch einen elektrochemischen Protonengradienten über die bakterielle Zellmembran erzeugt11. Daher dient OxlT als „virtuelle Protonenpumpe“, die eine protonentreibende Kraft für die bakterielle ATP-Synthese erzeugt11. Daher sind die funktionellen Eigenschaften von OxlT als Antiporter zwischen Oxalat und Formiat und nicht als Uniporter jeder Chemikalie für die Kopplung des Kohlenstoffstoffwechsels und der Energiebildung von wesentlicher Bedeutung. Insbesondere akzeptiert OxlT kein Oxalacetat (C4H2O52-) oder Succinat (C4H4O42-), bei denen es sich um Dicarboxylat-Zwischenprodukte des Krebszyklus handelt, als Substrate13. Diese Dicarboxylate mit vier Kohlenstoffatomen (C4-Dicarboxylate) sind wichtige Stoffwechselzwischenprodukte auf der bakteriellen Zytosolseite, während sie auch als Energiequellen und biosynthetische Vorläufer über einen Darmtransporter auf der Wirtslumenseite absorbiert werden14. Daher ist die Fähigkeit von OxlT, zwischen C2- und C4-Dicarboxylaten zu unterscheiden, entscheidend für die günstige Symbiose zwischen Wirtstieren und dem Darmbakterium.

OxlT gehört zur Major Facilitator Superfamily (MFS), der großen Transporterfamilie, deren Mitglieder ein breites Spektrum an Chemikalien transportieren10. MFS-Proteine ​​​​haben eine gemeinsame Architektur aus zwölf Transmembran(TM)-Helices, die symmetrische N- und C-terminale Hälften von sechs genduplizierten TM-Einheiten enthalten, mit einer Substratbindungsstelle in der Mitte des Moleküls15,16. Der Substrattransportmechanismus der MFS-Familie sowie anderer Transporterfamilien wird durch das „alternierende Zugangsmodell“17 erklärt, bei dem Transportermoleküle abwechselnd einen Hohlraum von der Bindungsstelle zu beiden Seiten der Membran öffnen und nach außen gerichtete, verschlossene und nach innen gerichtete Konformationen über eine „Wippschalter“-Bewegung der N- und C-terminalen Domänen, wodurch ein Substrattransfer über die Membran ermöglicht wird18,19,20. Obwohl eine Fülle von Strukturinformationen zu jedem MFS-Mitglied gesammelt wurde, beschränkt sich das aktuelle Wissen über die OFA-Familie weiterhin auf eine OxlT-Struktur, die ursprünglich durch Elektronenkristallographie bei 6,5 Å21,22 gelöst wurde. Daher muss der spezifische Oxalaterkennungs- und Antiportmechanismus von OxlT noch in einer Struktur mit höherer Auflösung aufgeklärt werden.

In dieser Studie berichten wir über die röntgenkristallographischen Strukturen von OxlT in oxalatgebundenen und ligandenfreien Formen, gelöst bei 3,0–3,3 Å, um die strukturellen Grundlagen dieser Schlüsseltransporterfunktionen zu verstehen, die der Symbiose dieses Oxalat abbauenden Bakteriums zugrunde liegen die Eingeweide.

Das Wildtyp-OxlT ist unter verschiedenen Bedingungen instabil, beispielsweise in Gegenwart von Chloridionen12,23, was den verfügbaren chemischen Raum für das Kristallisationsscreening erheblich einschränkt. Für die Strukturstudie von OxlT wurde eine Antikörper-unterstützte Kristallisationsstrategie übernommen. Im Allgemeinen können Fab- oder Fv-Antikörperfragmente, die spezifisch an Konformationsepitope in Membranproteinen binden, die hydrophile Oberfläche vergrößern, die für die Bildung starrer Kristallgitter zur Verfügung steht. Darüber hinaus können die gebundenen Antikörperfragmente die inhärente Proteinflexibilität und Konformationsheterogenität verringern und so die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Kristallisation von Membranproteinen erhöhen24,25. OxlT wurde durch die Bindung zweier unterschiedlicher Antikörperfragmente stabilisiert, was zur Kristallisation unter zwei unterschiedlichen Bedingungen führte. Wir haben bestätigt, dass die zur Kristallisation verwendeten Antikörperfragmente sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Oxalat an OxlT binden (ergänzende Abbildung 1). Daher ist es unwahrscheinlich, dass die Antikörperfragmente OxlT künstlich in einer bestimmten Konformation einfangen. Die Kristallstruktur von Oxalat-gebundenem OxlT im Komplex mit dem Fab-Fragment wurde bei 3,0 Å (PDB ID 8HPK) gelöst, während die von ligandenfreiem OxlT im Komplex mit einem Fv-Fragment bei 3,3 Å (PDB ID 8HPJ) gelöst wurde (Ergänzende Abb . 2a, b und Ergänzungstabellen 1 und 2).

Die Gesamtstruktur von OxlT besteht aus 12 TM-Helices (Abb. 1b, c), wie in der vorherigen EM-Struktur beobachtet und später als typische MFS-Architektur bestätigt. Im Oxalat-gebundenen Zustand nimmt das OxlT-Protein eine okkludierte Konformation ein, wobei ein Oxalatmolekül im Zentrum der Struktur bindet (Abb. 1b, e). Im Gegensatz dazu nimmt das ligandenfreie OxlT eine wesentlich andere Konformation an als die Oxalat-gebundene Form (Abb. 1c, d, f). Das OxlT-Protein weist einen großen V-förmigen Hohlraum zwischen der N- (TM1–6) und der C-terminalen (TM7–12) Domäne auf, der von der zentralen Oxalatbindungsstelle mit dem Periplasma verbunden ist, ein klares Zeichen für eine nach außen gerichtete Verbindung -zugewandte Konformation.

Bei einem Vergleich der verschlossenen und nach außen gerichteten Strukturen betrug die Cα-Root-Mean-Square-Abweichung (RMSD) für alle Reste 2,6–2,7 Å (Abb. 1d). Sogar die einzigen N- oder C-terminalen Domänen der beiden zeigten erhebliche strukturelle Unterschiede (Cα RMSD von ~1,5–1,6 Å). Daher wird der strukturelle Wechsel zwischen dem verschlossenen und dem nach außen gerichteten Zustand mit einer „Wippschalter“-Bewegung nicht durch die Neigung der starren Struktureinheiten erreicht, sondern geht mit deren Biegung einher. Tatsächlich werden bei TM1, 2, 4, 7, 8 und 11 in der nach außen gerichteten Struktur auffällige Biegungen im periplasmatischen Teil beobachtet, wobei die anderen umgebenden TM-Helices geneigt sind (Abb. 1d). Im Gegensatz dazu gab es keine nennenswerten Unterschiede im zytoplasmatischen Teil zwischen den beiden Konformationen. Bei anderen MFS-Proteinen wie GLUT5 und NarK wurde eine Biegung der Glycinreste in den TM-Helices zwischen den verschiedenen Konformationszuständen beobachtet26,27. OxlT hat 52 Glycinreste, was etwa einem Achtel (12,4 %) des Aminosäuregehalts entspricht (Abb. 1d, ergänzende Abbildungen 2c, d und 3). Bemerkenswert ist, dass diese Glycinhäufigkeit höher ist als die in anderen MFS-Proteinen wie LacY (8,6 %), GLUT5 (7,6 %) oder NarK (10,4 %) und in TM-Helices in anderen Membranproteinen (~8,7 %)28. Daher scheint die Akkumulation der Biegung der TM-Helices an den Glycinresten eine größere Rolle bei der Erzielung des Konformationswechsels zwischen den Zuständen in OxlT zu spielen. Glycinreste wurden auch an der Grenzfläche zwischen den N- und C-terminalen Domänen gefunden, wie in TM5 und TM8 oder TM2 und TM11 (ergänzende Abbildung 2c, d), und erreichten eine dichte helikale Packung, wie zuvor berichtet 28, 29. Das in OxlT beobachtete hohe Vorkommen von Glycin kann erforderlich sein, um das Oxalat, das für ein transportiertes Substrat klein ist, im Zentrum des Moleküls zu verschließen. Umgekehrt ist die glycinreiche Architektur wahrscheinlich für die Instabilität von OxlT in Detergensmizellen verantwortlich, die die Kristallisation in Abwesenheit von Antikörperfragmenten und Funktionstests behindert, wie unten beschrieben. Der hohe Glycinanteil wurde auch bei den anderen OFA-Proteinen beobachtet (10,2 ± 1,1 % mit 15 streng konservierten Positionen; beobachtet bei 11 Familienmitgliedern, dargestellt in der ergänzenden Abbildung 3) und könnte ein Familienmerkmal sein.

In der Kristallstruktur (PDB ID 8HPK) wird das an OxlT bindende Oxalatmolekül als verdrehte Konfiguration verfeinert (Abb. 2a und ergänzende Abb. 4a). Es ist bekannt, dass die Bindung zwischen den beiden Carboxylgruppen in einem Oxalat-Dianion einfach und nicht konjugiert ist, was eine freie Rotation der Carboxylgruppen um die CC-Bindung ermöglicht30. Da die Auflösung der Oxalat-gebundenen OxlT-Struktur nicht ausreicht, um den Diederwinkel von Oxalat genau zu bestimmen, haben wir quantenmechanische (QM) und quantenmechanische/molekulare mechanische (QM/MM) Berechnungen der Oxalatbindung in der okkludierten OxlT-Struktur durchgeführt Untersuchen Sie die energetisch minimierte Konformation. Die resultierenden OCCO-Diederwinkel im Oxalat lagen zwischen 50 und 68 ° (Ergänzungsabbildungen 4b, c und Ergänzungstabelle 3). Diese Werte liegen nahe an denen, die in der ursprünglichen Kristallstruktur beobachtet wurden (60,1˚), was beweist, dass das Oxalat in der Kristallstruktur nicht planar, sondern verdreht ist.

a Nahaufnahme der Bindungsstelle in Oxalat-gebundenem OxlT (PDB-ID: 8HPK). Gestrichelte Linien zeigen mögliche Wasserstoffbrückenbindungen und Salzbrücken an. Außerdem wird eine vergrößerte Ansicht des gebundenen Oxalatmoleküls mit Atommarkierungen gezeigt. b Überlagerung der Substratbindungsstellenstrukturen von OxlT (mit den unterstrichenen Markierungen) und NarK (grün, mit normalen Markierungen; PDB-ID: 4U4W) basierend auf der topologischen Ähnlichkeit der Aminosäurereste, die mit den Substraten interagieren. c Oxalatbindungsassay durch GFP-TS. Die Daten stellen Mittelwerte ± SEM der Erhöhungen der Schmelztemperaturen dar, die durch die Zugabe von 3 mM Kaliumoxalat in drei unabhängigen Experimenten verursacht wurden. WT: Wildtyp. d Oxalataufnahmetest unter Verwendung rekombinanter E. coli-Zellen. Angezeigt werden die relativen Transportaktivitäten des mutierten OxlT zu denen des am selben Tag gemessenen WT OxlT, eingestellt auf 100 %, während die der Zellen ohne OxlT36-Expression auf 0 % gesetzt wurden. Die Balken stellen die Mittelwerte der technisch duplizierten Messungen aus einem einzelnen Experiment für jeden Mutanten dar. Die Ergebnisse der R272A- und K355Q-Mutanten werden zum Vergleich aus der vorherigen Studie36 erneut veröffentlicht. e Proteoliposom-Oxalat-Aufnahmetest. Die resultierenden Oxalatkonzentrationen in Liposomenlysaten wurden gemessen und nach 60 Minuten auf die des WT OxlT normalisiert. Die Ergebnisse der Liposomen ohne OxlT werden als „leer“ angezeigt. Die Balken stellen die Mittelwerte der Ergebnisse in drei (Daten bei 0 Min. und 60 Min. für leer, WT und R272A) oder zwei (anderen) unabhängigen Experimenten dar. au: beliebige Einheit. In den Feldern c und e wurden die Daten durch eine zweiseitige einseitige Varianzanalyse mit dem Dunnett-Test mit dem WT OxlT als Kontrolle analysiert. Die genauen P-Werte sind in der Ergänzungstabelle 6 angegeben. *P < 0,05, * *P < 0,01, ***P < 0,001. Die roten Balken kennzeichnen die Mutanten (oder Mutationen am gleichen Rest), die in früheren Studien einen Aktivitätsverlust aufwiesen31,32,34. f Interdomäneninteraktionen schließen den Hohlraum zum Zytoplasma. g Ioneninteraktionsnetzwerk auf der zytoplasmatischen Seite von OxlT. h Interdomäneninteraktionen schließen den Hohlraum zum Periplasma.

An der Bindungsstelle in OxlT bindet Oxalat an den Transporter, wobei eine Carboxylgruppe eine zweizähnige Salzbrücke mit Arg272 in TM8 bildet, während die andere eine ionische Wechselwirkung mit Lys355 in TM11 eingeht (Abb. 2a). Zusätzlich zur Salzverbrückung mit dem Oxalat bildet die ε-Aminogruppe in Lys355 ein Wasserstoffbindungsnetzwerk zwischen den Domänen mit den Carboxamidgruppen in Gln34 (TM1) und Gln63 (TM2) in der N-terminalen Domäne. In ähnlicher Weise bildet die Guanidinogruppe in Arg272 eine Wasserstoffbrücke zwischen den Domänen mit der Hauptketten-Carbonylgruppe in Ala147 (TM5) und interagiert weiter mit der Seitenketten-Carboxamid- und Hauptketten-Carbonylgruppe von Asn268 stromaufwärts von TM8. Die Region um Arg272 ist aufgrund der Sequenz von N268GGCR272P der Biegepunkt in TM8, und daher behalten die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Arg272 und Asn268 wahrscheinlich die Konformation und Orientierung von TM8 in der oxalatgebundenen Struktur bei. Diese Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerke zwischen und innerhalb der Domäne, an denen Arg272 und Lys355 beteiligt sind, spielen wahrscheinlich eine entscheidende Rolle bei der Organisation der Struktur der Bindungstasche und der Stabilisierung der verschlossenen Konformation, obwohl sich diese beiden Grundreste innerhalb der C-terminalen Domäne befinden. Diese beiden Grundreste sind innerhalb der OFA-Familie konserviert (ergänzende Abbildung 3), sind für den Oxalattransport essentiell und sogar R272K- oder K355R-Mutationen reduzieren die Transportaktivität 31, 32, 33. Diese Ergebnisse bestätigen Beobachtungen, dass nicht nur die Ladungen, sondern auch die chemischen Strukturen der Seitenketten der beiden Reste für die strukturelle Organisation der Bindungsstelle wichtig sind.

Zusätzlich zu den beiden basischen Resten tragen zahlreiche aromatische Reste zur Oxalatbindung bei. Die Hydroxylgruppen von Tyr35 und Tyr124 bilden Wasserstoffbrücken mit jeder der Carboxylgruppen im Oxalat (Abb. 2a). Darüber hinaus bilden die aromatischen Seitenkettengruppen in Tyr150, Trp324, Tyr328 und Trp352 Face-to-Face- oder Edge-to-Face-π-π-Wechselwirkungen mit den Carboxylgruppen in Oxalat, was auf die Bedeutung der π-Elektronensysteme in Oxalat hinweist molekulare Erkennung durch OxlT. Diese sowohl in der N- als auch in der C-terminalen Hälfte verteilten aromatischen Reste und somit ihre Wechselwirkungen mit Oxalat stabilisieren auch den Verschluss der Hohlräume zwischen den Domänen, um die verschlossene Konformation zu erreichen. Darüber hinaus bildet Trp352 (TM11) eine Wasserstoffbrücke zwischen den Domänen mit Gln66 (TM2). Diese aromatischen Reste sind unter Proteinen der OFA-Familie konserviert (ergänzende Abbildung 3). Tatsächlich wurden Mutationen bei Tyr150 oder Trp352 in früheren Studien mit dem Verlust von Transportfunktionen in Verbindung gebracht31,34. Bemerkenswerterweise wurde eine ähnliche Kombination von ionischen und π-π-Wechselwirkungen bei der Erkennung von Nitrat, das ebenfalls über ein π-Elektronensystem verfügt, durch NarK in der Nitrat/Nitrit-Porter-Familie (NNP) beobachtet, obwohl die NNP-Familie weit entfernt ist aus der OFA-Familie10 und die Positionen der beteiligten Reste stimmen nicht überein (Abb. 2b).

Die Bedeutung der oben genannten oder ihrer benachbarten Reste für die Oxalatbindung und den Oxalattransport wurde untersucht. Da das gereinigte OxlT instabil ist, insbesondere in Abwesenheit von Substrat, verwendeten wir verschiedene Funktionstests: (1) den GFP-Thermoshift-Assay (GFP-TS)35, um die Fähigkeit der Oxalatbindung unter Verwendung des rohen, durch Detergenz solubilisierten Produkts zu beurteilen OxlT-GFP-Fusionsprotein, das Lipide aus den E. coli-Wirtszellen enthält; (2) ein In-Cellulo-Transportassay unter Verwendung von E. coli-Zellen, die OxlT36 rekombinant exprimieren; und (3) ein In-vitro-Transportassay unter Verwendung von Proteoliposomen, die mit dem gereinigten OxlT rekonstituiert wurden. Im GFP-TS-Assay zeigte Wildtyp-OxlT eine thermische Stabilisierung bei der Oxalatbindung. Im Gegensatz dazu war das Ausmaß der Oxalat-abhängigen thermischen Stabilisierung bei den mutierten OxlT-Proteinen Q34A, Y35A, Y124A, Y150A, N268A, R272A, W324A und K355Q verringert (Abb. 2c). Da sich die Thermostabilitäten der mutierten OxlT-Proteine ​​nicht signifikant von denen des Wildtyp-OxlT in Abwesenheit von Oxalat unterschieden (ergänzende Abbildung 5), legen diese Ergebnisse nahe, dass die Mutation an den Resten zu einer verringerten Bindungsaffinität von Oxalat und/oder oder verminderte Stabilität der gebundenen Struktur. Im In-Cellulo-Transportassay wurde das Ausmaß des Oxalat-Formiat-Austauschs durch OxlT in E. coli-Zellen, der negativ elektrogen ist, durch gekoppelten lichtgesteuerten Protonentransfer nach innen durch ein co-exprimiertes Xenorhodopsin und den daraus resultierenden pH-Anstieg bewertet externe Lösung36 (Abb. 2d). Zusätzlich zu den nicht-funktionellen Mutanten R272A und K355Q31,32, deren Aktivitätsverlust in unserer vorherigen Studie nachgewiesen wurde36, verringerten auch OxlT-Mutationen mit Q34A, Y35A, N268A, W324A, Y328A und W352A die Aktivität (Abb. 2d). Schließlich wurde der In-vitro-Transporttest unter Verwendung des gereinigten, in Proteoliposomen rekonstituierten OxlT für R272A und die Mutanten durchgeführt, die in früheren Studien nicht mit dieser Methode getestet wurden (Abb. 2e und ergänzende Abb. 6). Ein ähnlicher Trend wurde zwischen den Proteoliposom- und Cellulo-Assays beobachtet, trotz einiger kleiner Abweichungen aufgrund der Unterschiede in den beiden Systemen. Interessanterweise zeigten die meisten Mutanten eine Abnahme sowohl der Bindungs- als auch der Transportaktivitäten, während die Mutationen Y124A und W324A trotz der verringerten Oxalatbindungskapazität zumindest in keinem der Transporttests keine signifikanten Auswirkungen auf die Transportaktivitäten hatten. Diese Beobachtungen können durch die Tatsache erklärt werden, dass die Verringerung der Affinität zu einer Beschleunigung der Nettoaufnahme aufgrund eines Geschwindigkeits-Affinitäts-Kompromisses und/oder eines verringerten Substratausflusses führen kann37. Im Gegensatz dazu zeigten Y328A und W352A eine ähnliche Oxalatbindung, jedoch verringerte Oxalataufnahmeaktivitäten im Vergleich zum Wildtyp-OxlT, was auf die Bedeutung dieser Reste für den katalytischen Umsatz hinweist. Daher legen die Ergebnisse der Funktionsstudien nahe, dass die Reste in der Nähe des gebundenen Oxalats in der OxlT-Struktur eine wichtige Rolle bei der Oxalatbindung und/oder dem Oxalattransport spielen.

Die Wechselwirkungen zwischen dem Substrat und den Resten in der okkludierten OxlT-Kristallstruktur werden für das C2-Dicarboxylat-Oxalat optimiert. Da das Oxalatmolekül eng an der Bindungstasche anliegt, führt der Ersatz von Oxalat durch ein größeres Dicarboxylat, z. B. Zwischenprodukte des Krebszyklus, zu sterischen Konflikten mit den Resten in OxlT, was wahrscheinlich zu einer Destabilisierung der verschlossenen Konformation führt (ergänzende Abbildung 7a). Eine flexible Docking-Studie führte zu einer Position, die ein C3-Dicarboxylat, Malonat, in der Bindungsstelle des verschlossenen OxlT aufnehmen konnte, obwohl diese aufgrund der Neuanordnung von Aminosäureresten in der Bindungstasche im Vergleich zu Oxalat weniger Wechselwirkungen aufwies (Ergänzende Abb. 7b). Dies steht im Einklang mit der verringerten Affinität und Transportaktivität für Malonat mit einem Kd-Wert von 1,2 mM im Vergleich zu 0,02 mM für Oxalat13. Selbst beim flexiblen Andocken wurde keine Möglichkeit für die Bindung von C4-Dicarboxylaten an das verschlossene OxlT beobachtet, was mit einem früheren Bericht übereinstimmt, der darauf hindeutet, dass diese Moleküle nicht signifikant mit Oxalat um die Aufnahme durch OxlT13 konkurrieren. Der GFP-TS-Assay bestätigte die höchste Spezifität von Oxalat gegenüber OxlT; Die thermische Stabilisierung von OxlT wurde deutlich in Gegenwart von Oxalat (C2), jedoch nicht in Gegenwart von Malonat (C3) oder Succinat (C4) beobachtet (ergänzende Abbildung 7c).

Von der Oxalatbindungsstelle bis zum Zytoplasma oder Periplasma wurden umfangreiche intramolekulare Wechselwirkungen zwischen TM-Helices in den N- und C-terminalen Domänen beobachtet, wie z. B. TM2 und TM11, TM5 und TM8, den periplasmatischen Hälften von TM1 und TM7 und den zytoplasmatische Hälften von TM4 und TM10 (Abb. 2f – h). Diese Wechselwirkungen stabilisieren den Verschluss der Interdomänenhohlräume in der verschlossenen Struktur.

Auf der zytoplasmatischen Seite unterhalb der Oxalatbindungsstelle wurden hydrophobe Wechselwirkungen mit Met128 (TM4), Pro332 (TM10) und Tyr348 (TM11) beobachtet, gefolgt von polaren Wechselwirkungen zwischen Asn129 (TM4) und Ser344 (TM11), Arg133 (TM4) und die Carbonylgruppen der Hauptkette von Thr341 und Ala342 (TM11) (Abb. 2f). Diese Wechselwirkungen werden zusätzlich durch Ladungs-Dipol-Wechselwirkungen am zytoplasmatischen Ende unterstützt, die zwischen Asp78 (TM2) oder Asp280 (TM8) und den N-terminalen Enden von TM11 bzw. TM5 gebildet werden (Abb. 2g). Die beiden Aspartatreste befinden sich in den „A-ähnlichen“ Motiven in den Regionen TM2-3 (Sequenz „G74YFVD78KFGP82R83IP“, AL2-3) oder TM8-9 (G276FVSD280KIGR284YK, Sequenz, AL8-9) (ergänzende Abbildung 3). Motiv A ist eines der am häufigsten konservierten Motive in MFS-Proteinen, und D(+5) ist bekanntermaßen an Ladungs-Helix-Dipol-Wechselwirkungen zwischen Domänen beteiligt . Bemerkenswerterweise bilden diese Aspartatreste außerdem umfangreiche ionische Interaktionsnetzwerke auf der zytoplasmatischen Seite (Abb. 2g). Insbesondere bilden Asp78 und Arg133 in TM4 sowie die stromabwärts gelegenen Reste Asp137 und Arg16 in TM1 Salzbrücken. Weiter stromabwärts bildet Arg139 am N-terminalen Ende von TM5 ein Ladungsweiterleitungsnetzwerk mit Asp337, Arg284 und Asp280.

Auf der periplasmatischen Seite oberhalb der Oxalatbindungsstelle schließt eine Wasserstoffbrücke zwischen Thr38 (Seitenkette) in TM1 und Val240 (Rückgrat) in TM7 (2,72 Å) den Porentunnel in der verschlossenen Konformation (Abb. 2h). Oberhalb der Wasserstoffbrücke bilden Leu39 (TM1), Leu52 (TM2), Val244 und Pro245 (TM7) und Val261 (TM8) hydrophobe Wechselwirkungen.

Im Gegensatz zur verschlossenen Substratbindungsstelle im Oxalat-gebundenen OxlT ist im ligandenfreien OxlT ein großer Hohlraum von der Bindungsstelle zum periplasmatischen Raum offen (PDB ID 8HPJ; Abb. 1f). An der leeren Bindungsstelle klappt die Lys355-Seitenkette aufgrund der Ladungsabstoßung aus Arg272 heraus und verschiebt die Positionen gegenüber denen in der oxalatgebundenen Form (Abb. 3a). In der ligandenfreien Form bleiben die meisten der im oxalatgebundenen Zustand beobachteten Wasserstoffbrücken zwischen den Domänen erhalten. Allerdings ist die Verbindung zwischen Lys355 in der C-terminalen Domäne und Gln34 in der N-terminalen Domäne wahrscheinlich im ligandenfreien Zustand gestört, gemessen am Abstand zwischen den Seitenketten (>~4 Å). Positionsverschiebungen der umgebenden aromatischen Reste wie Tyr35, Tyr150, Trp324 und Tyr328 wurden ebenfalls beobachtet (Abb. 3b). Diese Veränderungen an der Substratbindungsstelle aufgrund des Fehlens von Oxalat liegen wahrscheinlich der strukturellen Neuordnung der Gesamtarchitektur zugrunde und führen zu einer Konformationsänderung zwischen dem verschlossenen und dem nach außen gerichteten Zustand. Bemerkenswert ist, dass der Hohlraum, der sich zum Periplasma öffnet, eine ausgedehnte positiv geladene Oberfläche aufwies (Abb. 1f und 3c). Diese grundlegende Eigenschaft wird hauptsächlich von Arg272 und Lys355 in der Bindungsstelle abgeleitet. Darüber hinaus sind nun die Seitenketten-Aminogruppen in Lys45 und Arg248 und die Amidgruppen in Gln34, Asn42, Gln56, Asn264, Asn265 und Asn268, die diesen Hohlraum auskleiden, dem Lösungsmittel ausgesetzt. Diese Gruppen und die positiven Dipolmomente der gebogenen Helices von TM1, TM5 und TM11 tragen auch zur Grundeigenschaft des gesamten Hohlraums bei (Abb. 3c). Die durch Arg272 und Lys355 verursachte Ladungsabstoßung an der leeren Ligandenbindungsstelle sowie die ausgedehnte Grundoberfläche des Hohlraums verhindern wahrscheinlich den Verschluss der Tasche zur verschlossenen Form in Abwesenheit von Oxalat und stabilisieren so einen offenen Zustand. Die Stabilität einer Konformation im offenen Zustand in Abwesenheit eines Substrats, die den Übergang in den okkludierten Zustand verhindert, liegt der OxlT-Funktion als Antiporter zugrunde, bei der der Konformationswechsel in Abwesenheit eines Substrats während des katalytischen Prozesses nicht möglich ist22,38. Eine ähnliche Situation wurde bei einem Nitrat/Nitrit-Antiporter NarK29 beobachtet, bei dem die positiv geladene Oberfläche des offenen Hohlraums die nach innen gerichtete Konformation stabilisierte26.

a Nahaufnahme der Bindungsstelle in ligandenfreiem OxlT (PDB-ID: 8HPJ), betrachtet aus der gleichen Ausrichtung wie in Abb. 2a. Die Domänenfarbcodierung ist wie in Abb. 1c. Die gestrichelten Linien zeigen mögliche Wasserstoffbrückenbindungen an. b Überlagerung der Substratbindungsstellenstrukturen von OxlT in oxalatgebundener und ligandenfreier Form. c Nahaufnahme der zum Periplasma offenen Höhle. Es werden auch Modelle polarer Rückstände gezeigt, die dem Hohlraum ausgesetzt sind, und die Oberfläche, die mit der elektrostatischen Potentialkarte bei ±5 kTe−1 gefärbt ist. In den Bildern a–c ist stellvertretend das als Kette A definierte Molekül dargestellt.

Andererseits zeigt der zytoplasmatische Teil der ligandenfreien OxlT-Struktur keine signifikanten Veränderungen gegenüber dem der Oxalat-gebundenen Struktur (Abb. 1d).

Um die Strukturdynamik von OxlT zu untersuchen, die den für den Transportzyklus notwendigen Konformationswechsel ermöglicht, führten wir Molekulardynamiksimulationen (MD) durch, die auf den oxalatgebundenen okkludierten und den ligandenfreien, nach außen gerichteten OxlT-Kristallstrukturen basierten.

Wir simulierten zunächst die Oxalatbindung an die ligandenfreie nach außen gerichtete Konformation (PDB ID 8HPJ), indem wir das Oxalat außerhalb des Proteins positionierten (Abb. 4a – c und ergänzende Abb. 8). Bei Gln34, Tyr35, Arg272, Tyr328 und Lys355 wurde eine Oxalationenbindung an die Bindungsstelle von OxlT beobachtet (Abb. 4b). Der Abstand zwischen den geometrischen Zentren des Oxalations und den Resten der Bindungsstelle mit einem Grenzabstand von 5 Å bestimmte die Bindung (Abb. 4c). Die Wechselwirkung des Oxalation mit Lys355 löste seine Ladungsabstoßung mit Arg272 in der ligandenfreien Form auf und stellte die Konfiguration der Seitenkette aus dem umgedrehten Zustand wieder her. Die schnelle Bindung des negativ geladenen Oxalationen wird durch eine ausgedehnte positiv geladene Oberfläche erleichtert (Abb. 1f und 3c). Die Stabilität der gebundenen Konformation hing vom Protonierungszustand von Lys355 ab (siehe Methoden zur pKa-Berechnung), der durch den luminalen pH-Wert im Darm, der je nach Region zwischen 5 und 8 variiert,40 und die hydrophobe Umgebung an der Bindungsstelle41 beeinflusst werden kann . Für das protonierte Lys355 wurde ein einziges Bindungsereignis beobachtet, und das gebundene Oxalation blieb für den Rest der Simulation größtenteils an der Bindungsstelle (graue Linie im oberen Feld von Abb. 4c). Im Gegensatz dazu wurden für das neutrale Lys355 mehrere Bindungs- und Entbindungsereignisse verschiedener Oxalationen beobachtet (farbige Linien im unteren Feld von Abb. 4c). Daraus ergibt sich eine höhere Belegungsrate von 98,6 % für das protonierte Lys355 als die von 77,0 % für das neutrale Lys355, die durch die obige Definition des gebundenen Zustands unter Verwendung des Oxalat- und Bindungsstellenabstands berechnet wird. Daher wird für das protonierte Lys355 eine niedrigere Oxalat-Dissoziationskonstante vorhergesagt. Während der 1,7-µs-Simulationen war die nach außen gerichtete Konformation von OxlT stabil, wie in der Darstellung des RMSD der Rückgratatome aus der nach außen gerichteten Kristallstruktur gezeigt (Abb. 4a). Die Ergebnisse legen nahe, dass es sich bei der in den Simulationen beobachteten Bindung des Oxalats um einen Bindungsmodus im Frühstadium handelt, dem eine Konformationsumordnung und Desolvatisierung der Bindungsstelle sowie der Übergang zur okkludierten Konformation folgen sollte, um die vollständig gebundene Konformation anzupassen.

a–c MD-Simulationen begannen mit der ligandenfreien, nach außen gerichteten OxlT-Kristallstruktur (PDB ID 8HPJ). a Die RMSDs der anfänglichen nach außen gerichteten Kristallstruktur sind für zwei Trajektorien mit unterschiedlichen Protonierungszuständen von Lys355 in unterschiedlichen Farben dargestellt. b Schnappschuss des an OxlT gebundenen Oxalats mit protoniertem Lys355. Im herausgezoomten Schnappschuss werden Wassermoleküle in einem Abstand von 15 Å vom Oxalation in der CPK-Farbe angezeigt, während diejenigen in einem Abstand von 15 bis 25 Å in Blau angezeigt werden. In der Nahaufnahme sind Wassermoleküle in einem Abstand von 15 Å vom Oxalation zu sehen. c Abstände der Oxalationen von der Bindungsstelle in einer einzelnen Flugbahn, entweder mit protoniertem Lys355 (oben) oder deprotoniertem Lys355 (unten), sind dargestellt. Zur Berechnung des Abstands wurden die geometrischen Zentren des Oxalations und die Reste der Bindungsstelle verwendet. Verschiedene Farben repräsentieren die verschiedenen Oxalationen, die in der Simulation enthalten sind. d–f-MD-Simulationen begannen mit der Oxalat-gebundenen okkludierten OxlT-Kristallstruktur (PDB ID 8HPK). d Die RMSDs der ursprünglich verschlossenen Kristallstruktur werden für drei unabhängige Trajektorien in verschiedenen Farben angezeigt. e Hydrophobe Tore von OxlT. Im oberen Feld ist die Anzahl der Wassermoleküle innerhalb einer Entfernung von 15, 8 und 4 Å vom gebundenen Oxalation in Braun, Gelb bzw. Rot aufgetragen. Im unteren Bereich wird ein Schnappschuss bei 1000 ns in der Verkleinerungs- und Nahaufnahmeansicht angezeigt. Wassermoleküle haben die gleiche Farbe wie in Tafel b. Siehe auch Zusatzfilm 1. f Der beobachtete Übergang von der verschlossenen zur nach außen gerichteten Konformation, ausgelöst durch den Gln34-Flip. Die Oxalation- und Bindungsstellenreste sind in der Stabdarstellung dargestellt. Gln34 wird durch den roten Kreis hervorgehoben. In der vdW-Darstellung sind Wassermoleküle dargestellt. Wassermoleküle haben die gleiche Farbe wie in Tafel b. Die gestrichelten Linien zwischen der Thr38-Seitenkette und der Val240-Hauptkette in Schwarz und Rot zeigen die Abstände innerhalb bzw. außerhalb der H-Brückenbindung. Siehe auch Ergänzungsfilm 2.

Als nächstes befassten wir uns mit der Konformationsdynamik der okkludierten Konformation (PDB ID 8HPK) im Oxalat-gebundenen Zustand. Während der 1-µs-Simulation blieben zwei von drei unabhängigen Trajektorien im verschlossenen Zustand (Abb. 4d). In der verschlossenen Konformation wurden die meisten Wassermoleküle während der Simulationen an bestimmten Positionen auf der periplasmatischen und zytoplasmatischen Seite des Transporters blockiert, obwohl einige in OxlT eintraten (Abb. 4e und Zusatzfilm 1). Eine Wasserdichte-Analyse identifizierte Strukturschichten, die während der Simulation den Eintritt von Wasser in die Oxalat-Bindungsstelle blockierten (ergänzende Abbildung 9). Eine davon ist eine hydrophobe Schicht, die aus Thr38 und Leu39 in TM1, Val244 in TM7 und Val261 in TM8 auf der periplasmatischen Seite besteht (unten links in Abb. 4e). Diese Schicht blockierte in Kombination mit der Wasserstoffbrücke zwischen Thr38 und Val240 in TM7 (dargestellt durch eine gestrichelte Linie im unteren linken Feld von Abb. 4e) auch den Austritt des Liganden zur extrazellulären Seite und diente somit als periplasmatisches Tor. Die andere Schicht besteht aus Met128 in TM4, Pro332 in TM10 und Tyr348 in TM11 auf der zytoplasmatischen Seite (unten rechts in Abb. 4e). Diese periplasmatischen und zytoplasmatischen hydrophoben Tore weisen zusammen mit der TM1-TM7-Wasserstoffbindung Ähnlichkeit mit dem zuvor beschriebenen NarK-Transporter auf, basierend auf Resten, die sich an ähnlichen Positionen wie in OxlT in der ausgerichteten Struktur befinden (ergänzende Abbildung 10). Dieses Ergebnis legt nahe, dass die hydrophoben Tore39 ein konservierter Mechanismus zwischen den beiden Transportern sind.

Im Gegensatz dazu wurde in einer Flugbahn von der verschlossenen Konformation aus eine Öffnung des periplasmatischen Tors beobachtet (blaue Linie in Abb. 4d). Beim Übergang erfolgte zuerst das Umdrehen der Gln34-Seitenkette von der Bindungsstelle (Abb. 4f, ergänzende Abb. 11a und ergänzender Film 2). Der Gln34-Flip führte zu einer Unterbrechung der Wasserstoffbindung mit Lys355, wie in der nach außen gerichteten Kristallstruktur beobachtet (Abb. 3a). Da sich Gln34 in TM1 eine Windung vor Thr38 befindet, verursachte die Umkehrung außerdem eine ständige Unterbrechung der Wasserstoffbindung zwischen Thr38 und Val240, die bereits vor der Umkehrung durch thermische Fluktuationen ein- und ausgeschaltet wurde (dargestellt durch eine gestrichelte Linie). in Abb. 4f und ergänzender Abb. 11b). Nach ca. 280 ns nach dem Gln34-Flip begann sich OxlT nach außen zu öffnen und viele Wassermoleküle gelangten in den Transporter (Abb. 4f und Zusatzfilm 2). Wir stellen fest, dass es sich beim Gln34-Flip um eine vorübergehende Konformation handelt und dass die Seitenkette nach Erreichen des nach außen gerichteten Zustands im letzten Teil der Simulation in die ursprüngliche Position zurückkehrte, was mit der Beobachtung an der nach außen gerichteten Kristallstruktur übereinstimmt (ergänzende Abbildung). 11a, c). Bemerkenswerterweise wurde der Gln34-Flip auch in einer Flugbahn beobachtet, die von der okkludierten Konformation mit Formiat ausging, das in der Bindungsstelle modelliert wurde (ergänzende Abbildung 12). In dieser Flugbahn wurde die Wasserstoffbindung zwischen Thr38 und Val240 nach dem Gln34-Flip erneut vollständig aufgebrochen, gefolgt von einem Übergang von der verschlossenen zur nach außen gerichteten Konformation, entsprechend der physiologischen Reaktion der Formiatfreisetzung an das Periplasma in O. formigenes . Im Gegensatz dazu wurde der Gln34-Flip in keiner der anderen Trajektorien beobachtet, die nicht mit dem Konformationsübergang sowohl in der Oxalat- als auch in der Formiat-gebundenen Form einhergingen (Ergänzende Abbildungen 11 und 12). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Gln34-Seitenkette in Verbindung mit der Wasserstoffbrücke zwischen Thr38 und Val240 als „Verriegelung des periplasmatischen Tors“ fungiert, um den Übergang von der verschlossenen zur nach außen gerichteten Konformation zu verhindern. Tatsächlich zeigte die Q34A-Mutante einen teilweisen Verlust der Bindungs- und Transportaktivitäten im Vergleich zum Wildtyp-Protein (Abb. 2c – e), was darauf hindeutet, dass die Mutation die verschlossene Konformation destabilisiert. Gln34 ist zusammen mit Thr38 innerhalb der OFA-Familie streng konserviert (ergänzende Abbildung 3).

Der OCCO-Diederwinkel des Oxalations in der verschlossenen Bindungsstelle betrug nach dem Gln34-Flip ~90° (ergänzende Abbildung 13a), was dem in Lösung beobachteten Wert entspricht. Dies steht im Gegensatz zu den beiden anderen Flugbahnen ohne Gln34-Flip, bei denen der Oxalat-Diederwinkel bei etwa 40–50° blieb (und seine umgekehrte Position bei 130–140°; ergänzende Abbildung 13a), was denen in der Kristallstruktur ähnelt und die QM/MM-Berechnungen. Interessanterweise waren die während der Simulation im gebundenen Oxalat am nach außen gerichteten OxlT beobachteten Werte breit verteilt mit Doppelpeaks bei ~60° und ~120° (ergänzende Abbildung 13b), die sich von denen in Lösung unterscheiden und diesen eher näher kommen in der verschlossenen Kristallstruktur. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das gebundene Oxalat seine Konformation als Reaktion auf die durch den OxlT-Konformationswechsel verursachte Umweltveränderung neu anordnet und eine günstige Konformation für den nachfolgenden Schritt im Transporterzyklus annimmt.

Während der 1-µs-Simulation wurde für keine der Trajektorien aus der verschlossenen Konformation eine Öffnung des zytoplasmatischen Tores beobachtet. Dies kann auf die umfangreichen Interdomänenwechselwirkungen zurückgeführt werden, die auf der zytoplasmatischen Seite beobachtet werden, wie etwa das Motiv A, an dem Ladungsweiterleitungsnetzwerke beteiligt sind (Abb. 2g), von dem bekannt ist, dass es die nach außen gerichtete Konformation stabilisiert . Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Übergang vom verschlossenen in den nach innen offenen Zustand im gesamten Transportprozess eine langsame Kinetik aufweist. Einer der rätselhaften Mutanten, der eine verringerte Oxalatbindung, aber beibehaltene Transportaktivität zeigt, Y124A (Abb. 2c – e), befindet sich am Eingang des zytoplasmatischen Tors unterhalb des gebundenen Oxalats (Abb. 2f und 4f). Die Mutation könnte die hydrophobe Schicht am Tor destabilisieren und deren Öffnung erleichtern, wahrscheinlich der geschwindigkeitsbestimmende Schritt des Transports, und könnte somit die verringerte Affinität zu Oxalat in seiner Transportaktivität kompensieren.

Die beiden Kristallstrukturen von OxlT und die darauf basierenden MD-Simulationen lieferten Hinweise zum Verständnis des alternierenden Zugangstransportprozesses von OxlT (Abb. 5). Der folgende Prozess wird anhand des elektrochemischen Gradienten beschrieben, der in O. formigenes im Darm gebildet wird. Für den Oxalataufnahmeprozess weist OxlT eine ausgedehnte positiv geladene Oberfläche in der zum Periplasma offenen Höhle auf, die eine Bindung von saurem Oxalat an die Bindungsstelle ermöglicht. Die positiv geladene Oberfläche vermeidet außerdem den Konformationsübergang zum nächsten Transportschritt in Abwesenheit des Substrats, der ein unverzichtbares Merkmal für einen Antiporter ist. Dennoch neutralisiert die Oxalatbindung die lokale positive Ladung und ermöglicht den Konformationswechsel von der nach außen gerichteten Konformation zur verschlossenen Konformation. Darüber hinaus zeigten die berechneten relativen freien Bindungsenergien von Oxalat an OxlT eine signifikante Stabilisierung der okkludierten Konformation im Vergleich zur nach außen offenen Konformation (d. h. ~20 kcal/mol Abnahme), was eine physikalische Grundlage für den durch Oxalat induzierten Konformationswechsel darstellt Bindung (siehe Abschnitt „Methoden“ und Ergänzungstabelle 4). Der verschlossene Zustand ist ein wesentlicher Schritt für den Transport und dient als Unterscheidungskontrollpunkt zwischen Oxalat und notwendigen Stoffwechselintermediaten des Wirts, wie z. B. denen im Krebszyklus, wobei die durch die Bindungstasche auferlegte Größenbeschränkung genutzt wird. Die verschlossene Konformation kann schließlich die Öffnung des zytoplasmatischen Tores und die Freisetzung von Oxalat in das Zytoplasma ermöglichen.

Die Konformationslandschaft von OxlT entlang der periplasmatischen und zytoplasmatischen Gate-Abstände ist im oberen rechten Feld dargestellt. Die Cα-Abstände der Gate-Reste in MD-Simulationen der verschlossenen und nach außen offenen Zustände und des Gln34-induzierten Übergangs sind in Rot, Gelb bzw. Blau dargestellt. Die Gate-Rest-Abstände in den aktuell verschlossenen (PDB ID 8HPK) und nach außen gerichteten (PDB ID 8HPJ) Kristallstrukturen sowie der nach innen gerichteten Nark-Kristallstruktur (PDB ID 4U4T) werden ebenfalls angezeigt.

Anschließend kann eine Formiatbindung an das nach innen gerichtete OxlT den Transporter in den verschlossenen Zustand zurückbringen. Der Konformationsübergang, der für die Rückkehr vom verschlossenen Zustand in den anfänglichen nach außen gerichteten Zustand im Antiport-Zyklus erforderlich ist, kann durch eine vorübergehende Umkehrung einer Seitenkette eines Substrat-Nachbarrests, Gln34, und eine Unterbrechung der Wasserstoffbindung zwischen Thr38 und Val240 erreicht werden . Die Konformationslandschaft, die durch die Abstände des periplasmatischen Tors (Thr38–Val240) und des zytoplasmatischen Tors (Met128–Pro332)42,44 dargestellt wird, die in den MD-Simulationen erfasst wurden, zeigt, dass die Ordnungsparameter die verschlossenen und nach außen gerichteten Konformationen gut trennen (rote und gelbe Diagramme, Abb . 5 Einschub). Dennoch zeigt die einzige Flugbahn, die den Gln34-Flip begleitet, einen vollständigen Übergang, der die am Endpunkt verdeckten und nach außen gerichteten Kristallstrukturen abdeckt (blaue Punkte im Einschub in Abb. 5). Der Mechanismus der Konformationsänderung, der durch einen einzelnen Seitenkettenwechsel ausgelöst werden kann, ist zusammen mit der durch den hohen Glycinanteil ermöglichten strukturellen Flexibilität wahrscheinlich für den schnellen katalytischen Umsatz von OxlT12 verantwortlich.

Diese strukturellen Beobachtungen deuten darauf hin, dass OxlT die MFS-Architektur nutzt und sich im Einklang mit einer günstigen Symbiose zwischen den Wirtstieren und den Darmmikroben entwickelt hat. Die strukturellen und funktionellen Eigenschaften von OxlT liegen wahrscheinlich auch denen der anderen Mitglieder der OFA-Familie zugrunde. Ungefähr 2.000 OFA-Mitglieder sind in der Datenbank45 registriert, und alle außer OxlT sind funktionell nicht charakterisiert. Daher trägt diese Studie auch zum Verständnis unbekannter „dunkler“ Proteinfamilien bei. Die Klärung der nach innen gerichteten Konformationen von OxlT (ein gepunkteter Kreis im Einschub von Abb. 5) ist die nächste Herausforderung beim Verständnis der Strukturbiologie von OxlT.

Alle Tierversuche entsprachen den Richtlinien des japanischen Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden vom Tierversuchsausschuss der Universität Tokio genehmigt (Genehmigungsnummer: RAC07101).

C-terminales Nona-His-markiertes OxlT vom O. formigenes-Stamm OxB46 wurde in E. coli XL3 bei 20 °C 24 Stunden lang mit 1 mM Isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) exprimiert. Bakterienzellen wurden in Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, 200 mM Kaliumacetat, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 5 mM MgCl2, 20 µg/ml DNaseI und 0,23 mg/ml Lysozym, pH 8,0) suspendiert und dann mit aufgeschlossen EmulsiFlex C-5 (Avestin). Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (9.600 × g für 30 Minuten) entfernt und Zellmembranen wurden dann durch Zentrifugation (185.000 × g für 1 Stunde) gesammelt. Die Membranfraktion wurde mit 40 mM n-Dodecly-β-d-Maltosid (DDM) in Puffer A (20 mM HEPES-KOH, 200 mM Kaliumacetat, 10 mM Kaliumoxalat und 20 % Glycerin, pH 8,0) solubilisiert und aufgetragen Ni-NTA-Superflow-Harz (QIAGEN) oder HisTrap FF-Rohöl (GE Healthcare) in einer XK16-Säule (GE Healthcare). Die Säule wurde mit Puffer A, der 1 mM DDM und 30–50 mM Imidazol enthielt, gewaschen und dann wurde das Protein mit Puffer A, der 1 mM DDM und 250 mM Imidazol enthielt, eluiert.

Ein Proteoliposom-Antigen wurde hergestellt, indem gereinigtes funktionelles OxlT in hoher Dichte in Phospholipidvesikeln rekonstituiert wurde, die aus einer 10:1-Mischung aus Ei-Phosphatidylcholin (PC) (Avanti Polar Lipids) und Adjuvans-Lipid A (Sigma) bestanden, um eine Immunantwort zu erleichtern. BALB/c-Mäuse (7 Wochen alte Weibchen) wurden mit dem Proteoliposom-Antigen durch drei Injektionen im Abstand von zwei Wochen immunisiert. Die Mäuse wurden unter Bedingungen mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei einer Umgebungstemperatur von 23 ± 3 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 40–60 % gehalten.

Monoklonale Maus-Antikörper gegen OxlT wurden wie zuvor beschrieben ausgewählt48. Antikörperproduzierende Hybridomzelllinien wurden unter Verwendung eines herkömmlichen Fusionsprotokolls erzeugt. Hybridomklone, die Antikörper produzierten, die Konformationsepitope in OxlT erkannten, wurden durch einen Liposomen-Enzym-Immunoassay (ELISA) an immobilisierten Phospholipidvesikeln, die gereinigtes OxlT enthielten, selektiert, was eine positive Selektion der Antikörper ermöglichte, die die native Konformation von OxlT erkannten. Ein zusätzliches Screening auf verringerte Antikörperbindung an SDS-denaturiertes OxlT wurde zur negativen Selektion gegen lineare Epitop-erkennende Antikörper verwendet. Die stabile Komplexbildung zwischen OxlT und jedem Antikörperklon wurde mit Fluoreszenzdetektions-Größenausschlusschromatographie überprüft. Ganze IgG-Moleküle, die aus dem groß angelegten Kulturüberstand monoklonaler Hybridome gesammelt und mithilfe der Protein-G-Affinitätschromatographie gereinigt wurden, wurden mit Papain verdaut, und Fab-Fragmente wurden mithilfe der HiLoad 16/600 Superdex200-Gelfiltration und anschließender Protein-A-Affinitätschromatographie isoliert. Die Sequenz des Fab wurde über Standard-5′-RACE unter Verwendung von aus Hybridomzellen isolierter Gesamt-RNA bestimmt.

Einzelkettige Fv (scFv)-Fragmente gegen OxlT wurden aus einer immunisierten Maus-Phagen-präsentierten Antikörperbibliothek herausgesucht49. Immunisierte Mäuse wurden eingeschläfert und ihre Splenozyten-RNA isoliert und mittels Reverse-Transkriptions-PCR in cDNA umgewandelt. Das VL- und VH-Repertoire wurde über einen flexiblen 18-Aminosäuren-Linker zusammengesetzt und in den Phagen-Display-Vektor pComb3XSS kloniert. Biotinylierte Proteoliposomen wurden durch Rekonstitution von OxlT mit einer Mischung aus Ei-PC und 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(cap-Biotinyl) (16:0 Biotinyl-Cap-PE; Avanti) hergestellt und als Bindung verwendet Ziele für die scFv-Phagenselektion. Die Ziele wurden auf Streptavidin-beschichteten paramagnetischen Perlen (Dynabeads) oder Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten (Nunc) immobilisiert. Nach vier Biopanning-Runden wurden Liposomen-ELISAs an periplasmatischen Extrakten einzelner Kolonien durchgeführt. Positive Klone wurden gesammelt und mit einem Biacore T100 (GE Healthcare) bewertet.

Antikörper-scFv-Fragmente sind für die Verwendung als Kristallisations-Chaperone unerwünscht, da sie intermolekular domänengetauschte Dimere bilden können und das Dimer-Monomer-Gleichgewicht die strukturelle Heterogenität erhöhen kann. Daher verwendeten wir Fv-Fragmente für Kristallisationsversuche. Das Fv-Fragment wurde in Brevibacillus choshinensis unter Verwendung des iRAT-Systems exprimiert50. Der Kulturüberstand wurde auf eine Ammoniumsulfatsättigung von 60 % eingestellt und der Niederschlag pelletiert, in TBS-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM und NaCl) gelöst und über Nacht gegen denselben Puffer dialysiert. Dialysierte Proteine ​​wurden mit Ni-NTA-Harz gemischt, das mit Puffer B (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl und 20 mM Imidazol) äquilibriert war. Gebundene Proteine ​​wurden mit Puffer C (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl und 250 mM Imidazol) eluiert, mit TEV-His6 gemischt und über Nacht gegen TBS-Puffer dialysiert. Gespaltener His6-Tag und TEV-His6 wurden unter Verwendung einer mit Puffer B äquilibrierten HisTrap-Säule entfernt. Das tagfreie Fv-Fragment wurde konzentriert und auf eine mit TBS-Puffer äquilibrierte HiLoad16/60 Superdex75-Säule (GE Healthcare) geladen. Peakfraktionen wurden gepoolt, konzentriert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 °C gelagert.

Zur Kristallisation von Oxalat-gebundenem OxlT im Komplex mit D5901Fab wurde das gereinigte OxlT mit gereinigtem D5901Fab in einem Molverhältnis von 1:1,3 bei 4 °C über Nacht gemischt und auf eine HiLoad 16/60 Superdex200 pg-Säule (GE Healthcare) unter Verwendung von Puffer D aufgetragen ( 20 mM MES-KOH, 200 mM Kaliumacetat, 10 mM Kaliumoxalat, 20 % Glycerin und 0,51 mM DDM, pH 6,2) als Laufpuffer. Die gereinigte Probe wurde in Puffer E (20 mM MES-KOH, 10 mM Kaliumoxalat und 0,51 mM DDM, pH 6,2) dialysiert. Kristalle wurden durch die Dampfdiffusionsmethode mit sitzendem Tropfen bei 20 °C durch Mischen der gereinigten Probe (~10 mg/ml) mit einer Reservoirlösung aus 0,1 M Natriumcitrat, pH 5,5, 0,05 M NaCl und 26 % (v/v) erhalten. PEG400. Vor der Datenerfassung wurden die Kristalle in flüssigem Stickstoff eingefroren.

Zur Kristallisation von ligandenfreiem OxlT im Komplex mit 20D033Fv wurde gereinigtes OxlT mit gereinigtem 20D033Fv im Molverhältnis 1:2 bei 4 °C über Nacht gemischt und mit Superdex200, 10/300 GL (GE Healthcare) in Puffer F (20 mM MES) erhöht -KOH, 100 mM Kaliumacetat, 10 mM Kaliumoxalat und 0,02 % DDM, pH 6,2). Die gereinigte Probe wurde in eine Lipid-Mesophase rekonstituiert. Die Protein-LCP-Mischung enthielt 50 % (Gew./Gew.) Proteinlösung, 45 % (Gew./Gew.) Monoolein (Sigma) und 5 % (Gew./Gew.) Cholesterin (Sigma). Die resultierende Lipid-Mesophase wurde als 50-μL-Tropfen in 96-Well-Glasplatten verteilt und mit 0,8 μL Fällungsmittellösung unter Verwendung eines NT8-LCP-Kristallisationsroboters (Formulatrix) überschichtet und dann mit dünnen Deckgläsern abgedeckt. Kristallisationsaufbauten und die 96-Well-Glassandwichplatten (Molecular Dimension) wurden bei 20 °C inkubiert. Kristalle wurden innerhalb einer Woche unter den folgenden Fällungsbedingungen erhalten: 100 mM Glycin, pH 9,0, 26–36 % (v/v) PEG400 und 50–150 mM MnCl2. Kristalle wurden mithilfe von Mesh Litholoops (Protein Wave) direkt aus der Lipid-Mesophase geerntet und in flüssigem Stickstoff blitzgekühlt.

Röntgenbeugungsdaten für Oxalat-gebundenes OxlT und für ligandenfreies OxlT wurden bei 1,0 Å an der SPring-8-Beamline BL41XU mit MX225HE (Raynoix) bzw. BL32XU mit einem EIGER X 9 M-Detektor (Dectris, Ltd) gesammelt. unter der Kontrolle von BSS51 und einem bei 100 K betriebenen Kryostrom. Die Daten wurden zusammengeführt, integriert und auf 2,6 Å (Oxalat-gebundenes OxlT) und 3,1 Å (ligandenfreies OxlT) skaliert, wobei das KAMO-System52 verwendet wurde, das BLEND53, XDS54 und XSCALE55 nutzt (Ergänzungstabelle 1). Die Anisotropie der Daten wurde mit dem STARANISO-Server56 korrigiert. Durch die Korrektur wurden viele schwache Reflexionen mit sehr geringer sphärischer Vollständigkeit in den Schalen mit höherer Auflösung gelöscht. Zur Verfeinerung verwendeten wir Daten zu 3,0 Å (Oxalat-gebundenes OxlT) und 3,3 Å (ligandenfreies OxlT), die mehr als 25 % (Oxalat-gebundenes OxlT) bzw. 22 % (ligandenfreies OxlT) enthielten Daten in der höchsten Shell. Die Kristallstruktur wurde durch molekularen Ersatz mit PHASER57 gelöst. Die Suchmodelle waren Strukturen von N- und C-terminalen Hälften des Glycerin-3-Phosphat-Transporters GlpT (PDB-ID: 1PW4)58 und eines Fab-Fragments (PDB-ID: 1XF4)59 für Oxalat-gebundenes OxlT sowie Strukturen von N - und C-terminale Hälften von Oxalat-gebundenem OxlT, die in dieser Studie bestimmt wurden (Reste 11–199 bzw. 204–404) und ein scFv-Fragment (PDB-ID: 5B3N)60 für ligandenfreies OxlT. Strukturmodelle wurden manuell mit COOT61 neu erstellt und mit Phenix62 verfeinert. Im ligandenfreien OxlT-Kristall wurden zwei OxlT-Einheiten (Kette A und D) in einer asymmetrischen Einheit gefunden. Es wurde kein signifikanter struktureller Unterschied zwischen den beiden beobachtet (Cα RMSD von 0,365 Å für die Reste 15–410). Statistiken zur Datenerfassung und -verfeinerung sind in den Ergänzungstabellen 1 und 2 aufgeführt. Die mit MolProbity63 analysierten Ramanchandran-Statistiken waren 97,8 % favorisiert, 2,2 % erlaubt und 0,0 % Ausreißer für Oxalat-gebundenes OxlT und 97,5 % favorisiert, 2,5 % erlaubt und 0,0 % Ausreißer für Ligandenfreies OxlT.

Die Ligandenbindung von OxlT wurde mithilfe des GFP Thermal Shift Assay (GFP-TS)35 bewertet. Der Expressionsvektor für die C-terminale GFPuv-Fusion OxlT wurde zuvor konstruiert23, und Mutationen wurden über PCR unter Verwendung von PrimeSTARMax (Takara Bio) und den in Supplementary Data 1 aufgeführten Oligonukleotidprimern in den Vektor eingeführt. Das Protein wurde in BL21(DE3) exprimiert. grundsätzlich wie im Unterabschnitt „Herstellung von OxlT“ beschrieben, wobei die Proteinproduktion bei einer OD600 von 0,8–0,9 gestartet und 20 Stunden lang bei 20 °C induziert wurde.

Bakterienzellen, die das C-terminale GFPuv-Fusions-OxlT exprimieren, wurden in Puffer G (20 mM HEPES-KOH, 300 mM Kaliumacetat, pH 7,0) suspendiert und durch Ultraschallbehandlung mit UD201 (TOMY) aufgeschlossen. Um eine Membranfraktion zu erhalten, wurden Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt (17.800 × g für 15 Minuten bei 4 °C) und die Überstände wurden dann bei 252.000 × g für 30 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Die Membranfraktionen wurden zweimal gewaschen, indem die Suspension mit Puffer G wiederholt wurde, gefolgt von einer Ultrazentrifugation bei 252.000 × g für 30 Minuten bei 4 °C. Membranfraktionen aus einer 20-ml-Kultur wurden mit 240 oder 480 µL Puffer G, der 1 % (w/v) DDM enthielt, solubilisiert. Nach einer einstündigen Solubilisierung bei 4 °C wurden die unlöslichen Materialien durch 20-minütige Ultrazentrifugation bei 161.000 × g bei 4 °C entfernt.

Für Mutantentests wurden die durch Detergens solubilisierten Wildtyp- und Mutanten-OxlT-GFPuv-Proteine ​​mit Puffer G verdünnt, der 1 % DDM enthielt, um die OxlT-GFPuv-Konzentration anzupassen und die gleichen Fluoreszenzintensitäten zu erzielen. Die Lösungen wurden dann 1 Stunde lang auf Eis in Gegenwart oder Abwesenheit von 3 mM Kaliumoxalat inkubiert. Für Ligandentests wurde die Wildtyp-OxlT-GFPuv-Lösung in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 mM Natriumoxalat, Natriummalonat oder Natriumsuccinat inkubiert. Nach der Inkubation wurde Octyl-β-d-glucosid in Puffer G bis zu einer Endkonzentration von 1 % zugegeben und die Lösungen 10 Minuten lang einer Hitzedenaturierung bei 30–80 °C unter Verwendung eines C-1000 Touch Thermal Cycler (BIO) unterzogen -RAD). Die aggregierten Fraktionen wurden dann durch Zentrifugieren der Lösungen bei 10.740–15.340 × g (14.000 U/min mit einem TOMY PCR96-02-Rotor, abhängig von den Röhrchenpositionen im Rotor) für 20 Minuten bei 4 °C entfernt. Die resultierenden Überstände wurden in eine 384-Well Low Volume Black Microplate (Corning) aliquotiert und die Fluoreszenzintensitäten wurden unter Verwendung eines Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific) bei einer Anregungswellenlänge von 395 nm und einer Emissionswellenlänge von 507 nm gemessen. Die beobachteten Fluoreszenzintensitäten wurden mit denen des Pufferhintergrunds subtrahiert und normalisiert, indem die Werte der Probe ohne Hitzedenaturierung auf 1 und des Hintergrunds auf 0 gesetzt wurden. Die Werte der scheinbaren Schmelztemperatur (Tm) wurden durch Anpassen der Fluoreszenzintensitätswerte an die geschätzt Gibbs-Helmholtz-Gleichung64 unter Verwendung von Kaleidagraph (Hulinks), unter der Annahme, dass sich das interessierende Protein in einem Gleichgewicht zwischen einem Faltungs- und einem Entfaltungszustand befindet, und der Festlegung der Enthalpie- und Wärmekapazitätsänderungen der Entfaltung (ΔH, ΔCp) und Tm als unabhängige Variablen. Die Daten wurden durch eine zweiseitige einseitige Varianzanalyse mit dem Dunnett-Test unter Verwendung des Wildtyps (WT) als Referenz in Prism 8 (GraphPad) analysiert. Die statistische Signifikanz ist als *P < 0,05 definiert.

Die Transportaktivität von OxlT wurde sowohl mithilfe eines In-Cellulo-Systems mit rekombinanten E. coli-Zellen als auch eines In-vitro-Systems mit Proteoliposomen, die mit dem gereinigten OxlT rekonstituiert wurden, bewertet. Für mutierte OxlT-Assays wurden Mutationen in den OxlT-Expressionsvektor pRSF-OxlT36 über PCR unter Verwendung von PrimeSTARMax und den in Supplementary Data 1 aufgeführten Oligonukleotidprimern eingeführt.

Im In-Cellulo-Assay wurde die OxlT-Aktivität durch Kopplung mit dem lichtgesteuerten nach innen gerichteten Protonentransfer durch in E. coli coexprimiertes Xenorhodopsin gemessen, wie zuvor beschrieben36. Kurz gesagt, E. coli BL21 (DE3)-Zellen, die mit den Expressionsvektoren für OxlT und Xenorhodopsin transformiert waren, wurden bei 37 °C kultiviert und die Proteinproduktion wurde durch die Zugabe von 1 mM IPTG und 10 µM all-trans-Retinal (Sigma) bei an induziert Absorption von 0,8–0,9 bei 600 nm. Nach einer 20-stündigen Kultur bei 20 °C wurden E. coli-Zellen durch Zentrifugation gesammelt und mit 50 mM K2SO4 auf eine Zelldichte mit OD bei 660 nm von ~10 suspendiert. Die lichtinduzierte pH-Änderung der Zellsuspension wurde mit einer pH-Elektrode bei 25 °C und kontinuierlichem Rühren überwacht. Die Zellsuspension wurde zunächst im Dunkeln gestellt, bis sich der pH-Wert der Probe stabilisierte. Die Probe wurde dann mit einer Xe-Lampe durch einen Sharp Cut Filter Y44 (ein Langpassfilter bei ≥420 nm, HOYA) 10 Minuten lang beleuchtet und die pH-Änderung in Abwesenheit von Oxalat (ΔpH0) überwacht. Die Lichtintensität wurde mithilfe eines optischen Leistungsmessers und eines optischen Sensors auf ~150 mW/cm2 bei 550 nm eingestellt. Die beleuchtete Probe wurde wieder in die Dunkelheit gestellt und als sich der pH-Wert stabilisierte, wurden der Probe 5 mM Kaliumoxalat zugesetzt, um den Transport über OxlT für 10 Minuten zu ermöglichen. Die Probe wurde erneut unter den gleichen Bedingungen wie oben beleuchtet und die pH-Änderung (ΔpHS) wurde überwacht. Die Transportaktivität wurde anhand der Differenz der pH-Änderung (ΔΔpH) zwischen ΔpHS und ΔpH0 bewertet; Dies wurde weiter korrigiert, indem die Hintergrunddifferenz-pH-Änderung (ΔΔpH) abgezogen wurde, die mit E. coli gemessen wurde, die Xenorhodopsin allein exprimierten. Die Aktivitäten für jeden Mutanten wurden durch den korrigierten ΔΔpH und das relative Expressionsniveau normalisiert, das durch Western-Blot unter Verwendung von Penta∙His-Antikörper (QIAGEN, Kat.-Nr. 34460, 1:2000-Verdünnung) analysiert wurde, von Wildtyp-OxlT, gemessen am am selben Tag des Experiments (Ergänzende Abbildung 14; die nicht zugeschnittenen Blots befinden sich in der Quelldatendatei). Wir haben auch einen Test für die Y150A-Mutante durchgeführt; Diese Mutante beeinflusste jedoch aus unbekannten Gründen das Expressionsniveau von Xenorhodopsin (ergänzende Abbildung 14), weshalb wir das Y150A-Ergebnis aus dieser Arbeit ausgeschlossen haben.

Im In-vitro-Assay wurden die WT- und mutierten OxlT-Proteine ​​wie oben und im Unterabschnitt „Herstellung von OxlT“ mit geringfügigen Modifikationen beschrieben exprimiert und gereinigt. Die OxlT-Proteine ​​wurden aus Ni-NTA-Harz in Abwesenheit von Glycerin im Elutionspuffer eluiert und auf einer Größenausschlusschromatographiesäule Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare), äquilibriert mit 20 mM MES-KOH, 200 mM Kaliumacetat, gereinigt , 0,2 mM DDM, pH 6,2. Die Monomerfraktionen wurden gepoolt, auf ~1 mg/ml konzentriert, mit 20 % (v/v) Glycerin ergänzt, quantifiziert, aliquotiert und zur weiteren Verwendung schockgefroren. Proteoliposomen wurden ähnlich wie in Lee et al.65 beschrieben hergestellt. Der Gesamtlipidextrakt von E. coli (Avanti, in Chloroform) wurde in Glasröhrchen aliquotiert, und das Lösungsmittel wurde mehr als 5 Minuten lang bei Raumtemperatur unter einem Stickstoffgasstrom verdampft. Um unilamellare Vesikel zu erhalten, wurden getrocknete E. coli-Lipide mit 6,7 mg/ml in einer Lösung mit 50 mM MOPS-KOH und 10 mM Kaliumformiat, pH 7,0, resuspendiert und 45 Sekunden lang in einem Wasserbad-Ultraschallgerät beschallt. Das unilamellare Vesikel wurde mit den gereinigten OxlT-Varianten bei einem Lipid:Protein-Verhältnis von 200:1 (w/w) oder mit dem äquivalenten Volumen des Kontrollpuffers (50 mM MOPS-KOH mit 1,57 mM DDM, das gleiche Volumen wie die OxlT-Lösung) rekonstituiert ) in Mikroröhrchen durch drei Einfrier- und Auftauzyklen unter Verwendung von Bädern aus flüssigem Stickstoff und Wasser. Rekonstituierte unilamellare Vesikel wurden dreimal für insgesamt 15 s mit einem Handsondengerät auf Eis beschallt, um (Proteo-)Liposomen mit einem Durchmesser von <200 nm zu bilden.

Oxalataufnahmetests wurden durch Zugabe von 50 mM Kaliumoxalat zur Liposomenlösung bei 20 °C eingeleitet. Vor Beginn der Experimente wurde das AG1-X8-Anionenaustauschharz (BioRad) mit einem 1:1-Volumen (Gew./Vol.) 150 mM Natriumacetat, pH 8,2, äquilibriert und durch einminütiges Zentrifugieren von 400 μl Aufschlämmung bei 700 °C hergestellt ×g und 4 °C auf einer Spinsäule. Insgesamt wurden 50 μl Reaktion entweder sofort oder nach der Inkubationszeit für die in den Abbildungen angegebene Zeit gesammelt. Durch Auftragen der Reaktionslösungen auf die AG1-X8-Spinsäulen und einminütiges Zentrifugieren bei 700 × g und 4 °C wurden die Oxalationen außerhalb der Liposomen entfernt und die Proben in einem Mikroröhrchen gesammelt. Anschließend wurden jeder Probe 5 μl einer 10 % (w/v) Triton-X100-Lösung (Nacalai tesque) zugesetzt, um Liposomen aufzulösen, die Oxalationen enthielten, die entweder in das Liposom transportiert wurden oder daran hafteten. Die relativen Oxalatkonzentrationen wurden mithilfe des Oxalate Oxidase (OxOx) Assay Kit (Abcam) in Verbindung mit einer Oxidationsreaktion unter Verwendung von rekombinantem OxOx (B. subtilis, Biovision) bestimmt. 10 μl Liposomenlysat wurden mit 10 μl Detektionspuffer (9 μl OxOx-Assay-Puffer, 0,4 μl OxOx-Konverter, 0,2 μl rote Sonde, 0,02 μg OxOx, bis zu 10 μl mit Wasser) in jeder Vertiefung einer 384-Well-Platte mit geringem Volumen gemischt (Corning) mit einer Mehrkanalpipette. Die Platte wurde sofort mit Varioskan Flash im fluorometrischen Kinetikmodus mit Anregung bei 535 nm (12 nm Bandbreite), Emission bei 587 nm, einer Integrationszeit von 200 ms und 20-Sekunden-Intervallen für insgesamt 83 Minuten bei Raumtemperatur ausgelesen. Die anfänglichen Steigungen der Fluoreszenz-Zeit-Kurven wurden durch lineare Regression anhand der ersten 600-s-Daten bestimmt und als Anfangsgeschwindigkeiten der OxOx-Reaktion interpretiert, die unter dieser Testbedingung linear mit der Oxalatkonzentration korrelierten (ergänzende Abbildung 6). . Für die OxlT-Varianten und die Negativkontrolle wurden mindestens zwei unabhängige Liposomenpräparate und Oxalattransporttests durchgeführt, und OxOx-Tests wurden für jede Bedingung doppelt oder vierfach durchgeführt. Das letzte Balkendiagramm zeigt die normalisierten Werte auf den Mittelwert der WT-Daten nach 60 Minuten an.

Die Daten (im Fall des In-vitro-Assays diejenigen nach 60 Minuten) wurden durch eine zweiseitige einseitige Varianzanalyse mit dem Dunnett-Test in Prism 8 unter Verwendung des WT als Referenz analysiert. Die statistische Signifikanz ist als *P < 0,05 definiert.

Die OxlT-Kristallstrukturen wurden als Ausgangsstrukturen verwendet, wobei Reste an der mit MODELLER66 modellierten zentralen Schleife fehlten. Protonierungszustände wurden mit PROPKA 3.167,68 mit dem Standardparameter analysiert. Basierend auf der Analyse weist Lys355 in der nach außen gerichteten Struktur einen abweichenden pKa-Wert von 7,00 auf. Diese Abweichung wurde in der verschlossenen Struktur nicht beobachtet (pKa-Wert von 8,61). Daher wurden beide Protonierungszustände für Lys355 im nach außen gerichteten Zustand betrachtet. Das OxlT-Protein wurde mithilfe des Membrane Builder-Plugins in CHARMM-GUI69,70 in die Membran eingebettet. Es wurde eine 1-Palmitoyl-2-oleoylphosphatidylethanolamin (POPE)-Doppelschicht mit einer Länge von 120 Å für die x- und y-Dimensionen verwendet. Das PE-Lipid ist ein Hauptbestandteil sowohl von O. formigenes71, von dem OxlT abgeleitet ist, als auch von E. coli72, in dem Transporttests durchgeführt wurden. Darüber hinaus gibt es keine Hinweise darauf, dass andere spezifische Lipide für die OxlT-Aktivität erforderlich sind. Das Protein-Membran-System wurde mit TIP3P-Wassermolekülen und 150 mM KCl solvatisiert, was zu einer z-Dimensionslänge von 100 Å führte. Anschließend wurden alle 87 Cl– mit AmberTools1773 durch 58 Oxalationen ersetzt, ohne die Gesamtladung zu ändern, indem die skalierte effektive Ladung (–1,5e) des Oxalatmodells in Lösung berücksichtigt wurde (siehe ECCR unten). Das endgültige MD-System enthielt 146015 bzw. 143611 Atome für das verschlossene bzw. nach außen gerichtete OxlT-System. Anschließend wurden MD-Simulationen mit NAMD 2.1274 durchgeführt. Die Kraftfelder Amber ff14SB und Lipid14 wurden zur Beschreibung des Proteins bzw. der Membran eingesetzt75,76. Der Oxalatligand in Lösung wurde mit Parametern beschrieben, die durch die elektronische Kontinuumskorrektur mit Neuskalierung (ECCR) bestimmt wurden, basierend auf der von Kroutil et al. entwickelten Ab-initio-Molecular-Dynamic-Simulation43,77. Der Oxalatligand in der Bindungsstelle von OxlT wurde unter Verwendung von Parametern beschrieben, die mit dem RESP-Schema (Restrained Electrostatic Potential)78 ohne Anwendung der ECCR-Korrektur bestimmt wurden, da sich die Proteinumgebung von der einer Wasserlösung unterscheidet. Die RESP-Gebühren wurden von der Antechamber-Software79 berechnet. Unseres Wissens hat noch keine Studie die Komplexierung von Oxalat mit Protein simuliert, obwohl mehrere MD-Studien die Solvatisierung von Oxalatanionen in großen Mengen, ihre Komplexierung mit Calciumkationen und den Adsorptionsprozess an der Oberfläche simuliert haben80,81,82. Das MD-System wurde mit einer Minimierung für 10.000 Schritte eingerichtet, von 0 auf 10 K mit einem Schritt von 0,1 ns pro Grad im NVT-Ensemble erhitzt, dann von 10 auf 310 K im NPT mit einem Schritt von 0,2 ns pro 30 Grad und 10 ns der Äquilibrierung mit NPT-Ensemblesimulation bei 310 K. Anschließend wurden Produktionsläufe von 1,0 bzw. 1,7 μs unter NPT-Bedingungen für das verschlossene bzw. nach außen gerichtete OxlT-System (für jeden Protonierungszustand von Lys355) durchgeführt. Mit dem Langevin-Thermostat wurde eine Temperatur von 310 K aufrechterhalten, wobei der Druck mit dem Nosé-Hoover-Langevin-Kolben auf 1 Atmosphäre eingestellt wurde. Es wurden periodische Randbedingungen angewendet und weitreichende elektrostatische Wechselwirkungen mit der Partikelnetz-Ewald-Methode mit einem realen Grenzbereich von 12 Å und einer Schaltfunktion bei 10 Å behandelt. Der Integrationszeitschritt betrug 2 fs.

Um das Simulationssystem mit Formiat zu etablieren, wurde eine Carboxylateinheit des Oxalats, die auf Lys355 zeigt, durch ein Wasserstoffatom in der oxalatgebundenen eingeschlossenen Struktur ersetzt, um die ursprüngliche Struktur des Formiat-OxlT-Komplexes zu erzeugen. Darüber hinaus wurde aus dem Vorgängermodell ein K+-Ion entfernt und durch ein Wassermolekül ersetzt, um den Verlust einer negativen Ladung auszugleichen. Für Formiat wurden GAFF-Kraftfeldparameter79 verwendet. Es wurden die gleichen Äquilibrierungs- und Produktionsprotokolle wie oben beschrieben durchgeführt. Die vollständige Relaxation des OxlT-Proteins am Ende des Äquilibrierungsschritts garantiert eine gute Anpassung der Bindungsstelle für einen kleineren Liganden sowie eine realistische Konformation für Produktionsläufe.

Als Zusammenfassung der Simulationssysteme haben wir vier Systeme mit unterschiedlichen Kombinationen der Ausgangsstruktur (nach außen offene oder verschlossene Struktur), dem Protonierungszustand von Lys355 und dem gebundenen Liganden (Oxalat oder Formiat; im Fall der verschlossenen Struktur) konstruiert Struktur). In der Ergänzungstabelle 5 sind diese Simulationssysteme sowie die Anzahl der Trajektorien und die gesamte Simulationszeit zusammengefasst.

Die relative freie Bindungsenergie von Oxalat an OxlT wurde mit der MM/GBSA-Methode berechnet, die im Programm MMPBSA.py83 implementiert ist. Bei der MM/GBSA-Methode wird die freie Bindungsenergie in Gasphasen- und Solvatationsenergien zerlegt, die durch das Kraftfeld der Molekularmechanik (MM) und das verallgemeinerte implizite Born-Lösungsmittelmodell mit der lösungsmittelzugänglichen Oberfläche (GBSA) berechnet werden. jeweils. Beachten Sie, dass der Entropieeffekt nicht in die Berechnung einbezogen wurde. Wir haben eine Trajektorie analysiert, die den Konformationsübergang vom verschlossenen in den nach außen offenen Zustand darstellt (Abb. 4d, f und ergänzende Abb. 13a). Die Flugbahn wurde in drei Phasen unterteilt: das okkludierte OxlT mit dem Oxalat-Dieder ~50° (0–40 ns; bezeichnet als OxlT-occ-dih50), das okkludierte OxlT mit dem Oxalat-Dieder ~90° (41–320 ns; OxlT). -occ-dih90) und das nach außen offene OxlT mit dem Oxalat-Dieder ~90° (321–1000 ns; OxlT-op-dih90). Die freie MM/GBSA-Bindungsenergie wurde für jede Trajektorienstufe bestimmt (siehe Ergänzungstabelle 4).

Die Wasserdichte während der Simulation wurde von einem Modul von MDAnalysis84 berechnet, nachdem das Protein zentriert und überlagert wurde.

Mehrere QM/MM-Modelle wurden mit der Oxalat-gebundenen Struktur (PDB ID 8HPK) verwendet, um die Relevanz der Bindungsstellenumgebung für die interne Konformation von Oxalat zu bewerten. Zunächst wurde der Oxalatligand dem QM-Teil zugeordnet, während das gesamte Protein dem MM-Teil zugeordnet wurde. Zweitens wurde dem QM-Teil die erste Hülle aus Resten hinzugefügt, die direkt mit dem Liganden interagieren (Gln34, Tyr35, Tyr124, Arg272 und Lys355). Drittens wurde die zweite Hülle der Bindungsstelle (Tyr150, Trp324, Tyr328 und Trp352) zum QM-Teil hinzugefügt, um eine vollständige Umgebung der Bindungsstelle um den Oxalatliganden herum zu schaffen. Alle QM/MM-Berechnungen wurden mit ONIOM85 durchgeführt, implementiert in Gaussian 1686. Die Methode der Dichtefunktionaltheorie (DFT)87,88 wurde verwendet, um die QM-Region auf dem B3LYP/6-31 + G(d,p)-Niveau der Theorie zu behandeln89 ,90, einschließlich Grimmes Dispersionskorrektur mit Becke-Johnson-Dämpfung (D3BJ)91. Der MM-Bereich des Systems wurde durch dasselbe Kraftfeld beschrieben wie in den MD-Simulationen. Das elektronische Einbettungsschema wurde so verwendet, dass die MM-Region die elektronische QM-Dichte polarisiert. Für jeden Rest in der QM-Region wurde ein explizites Verbindungsatom zwischen den α- und β-Kohlenstoffatomen hinzugefügt, um die kovalente Grenze zwischen den QM- und MM-Teilen zu handhaben. Minima der potentiellen Energieoberfläche wurden dadurch bestätigt, dass sie keine imaginären Frequenzen aufwiesen. Zusätzliche reine DFT-Berechnungen des Oxalatliganden mit festen Seitenketten der Bindungsstellenreste wurden mit dem gleichen QM-Theorieniveau wie in den QM/MM-Berechnungen durchgeführt. Wie bei QM/MM-Berechnungen waren optimierte Strukturen, die als stationäre Punkte auf der potentiellen Energieoberfläche erhalten wurden, echte energetische Minima ohne imaginäre Frequenzen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Koordinaten und Strukturfaktoren für OxlT wurden in der Proteindatenbank unter den Zugangsnummern 8HPK (OxlT-fab-Komplex; Oxalat-gebundene okkludierte Form)92 und 8HPJ (OxlT-Fv-Komplex; ligandenfreie, nach außen gerichtete Form)93 hinterlegt. Die MD-bezogenen Daten wurden im Zenodo-Repository [https://doi.org/10.5281/zenodo.7597686]94 hinterlegt. In dieser Studie wurden Koordinaten mit den PDB-IDs 1PW458, 1XF459, 5B3N60, 4U4W95, 4U4T96 und Aminosäuresequenzen der OFA-Familie (IPR026355) verwendet. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Marengo, SR & Romani, AM Oxalat bei Nierensteinerkrankungen: der Endmetabolit, der einfach nicht verschwindet. Nat. Klin. Üben. Nephrol. 4, 368–377 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Massey, LK Lebensmitteloxalat: Faktoren, die die Messung, biologische Variation und Bioverfügbarkeit beeinflussen. Marmelade. Diät. Assoc. 107, 1191–1194 (2007).

Artikel PubMed Google Scholar

Miller, AW & Dearing, D. Die metabolischen und ökologischen Wechselwirkungen oxalatabbauender Bakterien im Darm von Säugetieren. Pathogens 2, 636–652 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Allison, MJ, Dawson, KA, Mayberry, WR & Foss, JG Oxalobacter formigenes gen. Nov., sp. nov.: Oxalat abbauende Anaerobier, die im Magen-Darm-Trakt leben. Bogen. Mikrobiol. 141, 1–7 (1985).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Daniel, SL et al. Vierzig Jahre Oxalobacter formigenes, ein mutiger Oxalat-abbauender Spezialist. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 87, e0054421 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Mehta, M., Goldfarb, DS & Nazzal, L. Die Rolle des Mikrobioms bei der Nierensteinbildung. Int. J. Surg. 36, 607–612 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Sidhu, H. et al. Fehlen von Oxalobacter formigenes bei Mukoviszidose-Patienten: ein Risikofaktor für Hyperoxalurie. Lancet 352, 1026–1029 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kumar, R., Ghoshal, UC, Singh, G. & Mittal, RD Seltenheit der Kolonisierung mit Oxalobacter formigenes bei entzündlichen Darmerkrankungen: mögliche Rolle bei der Bildung von Nierensteinen. J. Gastroenterol. Hepatol. 19, 1403–1409 (2004).

Artikel PubMed Google Scholar

Allison, MJ, Cook, HM, Milne, DB, Gallagher, S. & Clayman, RV Oxalatabbau durch Magen-Darm-Bakterien beim Menschen. J. Nutr. 116, 455–460 (1986).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pao, SS, Paulsen, IT & Saier, MH Jr. Große Moderatoren-Superfamilie. Mikrobiol. Mol. Biol. Rev. 62, 1–34 (1998).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Anantharam, V., Allison, MJ & Maloney, PC Oxalat:Formiat-Austausch. Die Grundlage für die Energiekopplung bei Oxalobacter. J. Biol. Chem. 264, 7244–7250 (1989).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ruan, ZS et al. Identifizierung, Reinigung und Rekonstitution von OxlT, dem Oxalat-Formiat-Antiport-Protein von Oxalobacter formigenes. J. Biol. Chem. 267, 10537–10543 (1992).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Maloney, PC, Anantharam, V. & Allison, MJ Messung der Substratdissoziationskonstante eines solubilisierten Membranträgers. Substratstabilisierung von OxlT, dem Anionenaustauschprotein von Oxalobacter formigenes. J. Biol. Chem. 267, 10531–10536 (1992).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pajor, AM Natriumgekoppelte Dicarboxylat- und Citrattransporter aus der SLC13-Familie. Pflug. Bogen. 466, 119–130 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Abramson, J. et al. Struktur und Mechanismus der Laktosepermease von Escherichia coli. Wissenschaft 301, 610–615 (2003).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Huang, Y., Lemieux, MJ, Song, J., Auer, M. & Wang, DN Struktur und Mechanismus des Glycerin-3-Phosphat-Transporters aus Escherichia coli. Wissenschaft 301, 616–620 (2003).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Jardetzky, O. Einfaches allosterisches Modell für Membranpumpen. Natur 211, 969–970 (1966).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Yan, N. Strukturbiologie der wichtigsten Transporter der Superfamilie. Annu. Rev. Biophys. 44, 257–283 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Quistgaard, EM, Low, C., Guettou, F. & Nordlund, P. Transport durch die Major Facilitator Superfamily (MFS) verstehen: Strukturen ebnen den Weg. Nat. Rev. Mol. Zellbiol. 17, 123–132 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Drew, D., North, RA, Nagarathinam, K. & Tanabe, M. Strukturen und allgemeine Transportmechanismen der Major Facilitator Superfamily (MFS). Chem. Rev. 121, 5289–5335 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hirai, T. et al. Dreidimensionale Struktur eines bakteriellen Oxalattransporters. Nat. Struktur. Biol. 9, 597–600 (2002).

CAS PubMed Google Scholar

Hirai, T. & Subramaniam, S. Struktur und Transportmechanismus des bakteriellen Oxalattransporters OxlT. Biophys. J. 87, 3600–3607 (2004).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ihara, M., Matsuura, N. & Yamashita, A. Hochauflösende native PAGE für Membranproteine, die zur Fluoreszenzdetektion und zur Bewertung des hydrodynamischen Zustands geeignet ist. Anal. Biochem. 412, 217–223 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hunte, C. & Michel, H. Kristallisation von Membranproteinen, vermittelt durch Antikörperfragmente. Curr. Meinung. Struktur. Biol. 12, 503–508 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bukowska, MA & Grutter, MG Neue Konzepte und Hilfsmittel zur Erleichterung der Kristallisation. Curr. Meinung. Struktur. Biol. 23, 409–416 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fukuda, M. et al. Strukturelle Grundlage für den dynamischen Mechanismus des Nitrat/Nitrit-Antiports durch NarK. Nat. Komm. 6, 7097 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Nomura, N. et al. Struktur und Mechanismus des Säugetier-Fruktosetransporters GLUT5. Natur 526, 397–401 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Javadpour, MM, Eilers, M., Groesbeek, M. & Smith, SO Helix-Packung in polytopischen Membranproteinen: Rolle von Glycin bei der Transmembran-Helix-Assoziation. Biophys. J. 77, 1609–1618 (1999).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zheng, H., Wisedchaisri, G. & Gonen, T. Kristallstruktur eines Nitrat/Nitrit-Austauschers. Natur 497, 647–651 (2013).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dean, PAW Das Oxalat-Dianion, C2O42-: planar oder nichtplanar? J. Chem. Educ. 89, 417–418 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Fu, D., Sarker, RI, Abe, K., Bolton, E. & Maloney, PC Struktur-/Funktionsbeziehungen in OxlT, dem Oxalat-Formiat-Transporter von Oxalobacter formigenes. Zuordnung der Transmembranhelix 11 zum Translokationsweg. J. Biol. Chem. 276, 8753–8760 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yang, Q. et al. Experimentelle Tests eines Homologiemodells für OxlT, den Oxalattransporter von Oxalobacter formigenes. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 102, 8513–8518 (2005).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, X., Sarker, RI & Maloney, PC Analyse substratbindender Elemente in OxlT, dem Oxalat:Formiat-Antiporter von Oxalobacter formigenes. Biochemistry 45, 10344–10350 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, Biochemistry 47, 5709–5717 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M. & Drew, D. Ein konstruierter Thermoverschiebungsbildschirm zeigt spezifische Lipidpräferenzen eukaryotischer und prokaryotischer Membranproteine. Nat. Komm. 9, 4253 (2018).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hayashi, M., Kojima, K., Sudo, Y. & Yamashita, A. Eine optogenetische Testmethode für elektrogene Transporter unter Verwendung einer lichtgetriebenen Protonenpumpe mit Escherichia coli-Koexpression. Proteinwissenschaft. 30, 2161–2169 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bosdriesz, E. et al. Uniporter-Trägerproteine ​​mit niedriger Affinität können die Nettosubstrataufnahmerate erhöhen, indem sie den Efflux reduzieren. Wissenschaft. Rep. 8, 5576 (2018).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, XC, Zhao, Y., Heng, J. & Jiang, D. Energiekopplungsmechanismen von MFS-Transportern. Proteinwissenschaft. 24, 1560–1579 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Okazaki, KI et al. Mechanismus des elektroneutralen Natrium/Protonen-Antiporters PaNhaP aus dem Übergangspfadschießen. Nat. Komm. 10, 1742 (2019).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koziolek, M. et al. Untersuchung von pH- und Temperaturprofilen im Magen-Darm-Trakt nüchterner Menschen mit dem Intellicap((R))-System. J. Pharm. Wissenschaft. 104, 2855–2863 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Takayama, Y., Castaneda, CA, Chimenti, M., Garcia-Moreno, B. & Iwahara, J. Direkter Beweis für die Deprotonierung einer Lysinseitenkette, die im hydrophoben Kern eines Proteins verborgen ist. Marmelade. Chem. Soc. 130, 6714–6715 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Feng, J., Selvam, B. & Shukla, D. Wie tauschen Antiporter Substrate über die Zellmembran aus? Eine Beschreibung des gesamten Austauschzyklus in NarK auf atomarer Ebene. Struktur 29, 922–933.e923 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kroutil, O., Predota, M. & Kabelac, M. Kraftfeldparametrisierung von Hydrogenoxalat- und Oxalatanionen mit skalierten Ladungen. J. Mol. Modell 23, 327 (2017).

Artikel PubMed Google Scholar

Stelzl, LS, Fowler, PW, Sansom, MS & Beckstein, O. Flexible Gates erzeugen verschlossene Zwischenprodukte im Transportzyklus von LacY. J. Mol. Biol. 426, 735–751 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blum, M. et al. Die InterPro-Datenbank für Proteinfamilien und -domänen: 20 Jahre später. Nukleinsäuren Res. 49, D344–D354 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Abe, K., Ruan, ZS & Maloney, PC Klonierung, Sequenzierung und Expression von OxlT, dem Oxalat-Formiat-Austauschprotein von Oxalobacter formigenes, in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 271, 6789–6793 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fu, D. & Maloney, PC Bewertung der Sekundärstruktur von OxlT, dem Oxalattransporter von Oxalobacter formigenes, mittels Zirkulardichroismus-Spektroskopie. J. Biol. Chem. 272, 2129–2135 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jaenecke, F. et al. Erzeugung konformationsspezifischer Antikörperfragmente zur Kristallisation des Multiresistenztransporters MdfA. Methoden Mol. Biol. 1700, 97–109 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Suharni et al. Proteoliposombasierte Selektion eines rekombinanten Antikörperfragments gegen den menschlichen M2-Muskarin-Acetylcholinrezeptor. Monoklon. Antib. Immundiagn. Immunander. 33, 378–385 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nomura, Y. et al. Das dazwischenliegende Produktionssystem „Removable Affinity Tag“ (iRAT) erleichtert die durch Fv-Antikörperfragmente vermittelte Kristallographie. Proteinwissenschaft. 25, 2268–2276 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ueno, G., Kanda, H., Kumasaka, T. & Yamamoto, M. Beamline Scheduling Software: Verwaltungssoftware für den automatischen Betrieb der RIKEN-Strukturgenomik-Beamlines bei SPring-8. J. Synchrotronstrahlung. 12, 380–384 (2005).

Artikel PubMed Google Scholar

Yamashita, K., Hirata, K. & Yamamoto, M. KAMO: Auf dem Weg zur automatisierten Datenverarbeitung für Mikrokristalle. Acta Crystallogr. D-Struktur. Biol. 74, 441–449 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Foadi, J. et al. Clustering-Verfahren zur optimalen Auswahl von Datensätzen aus mehreren Kristallen in der makromolekularen Kristallographie. Acta Crystallogr. D Biol. Kristalllogr. 69, 1617–1632 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr. D Biol. Kristalllogr. 66, 125–132 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kabsch, W. Integration, Skalierung, Raumgruppenzuordnung und Nachverfeinerung. Acta Crystallogr. D Biol. Kristalllogr. 66, 133–144 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tickle, IJ et al. STARANISO https://staraniso.globalphasing.org/cgi-bin/staraniso.cgi (2018).

McCoy, AJ et al. Phaser-Kristallographiesoftware. J. Appl Crystallogr. 40, 658–674 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, Y., Lemieux, MJ, Song, J., Auer, M. & Wang, DN Kristallstruktur des Glycerin-3-phosphat-Transporters aus E. coli. Proteindatenbank https://doi.org/10.2210/pdb1PW4/pdb (2003).

Schuermann, JP, Prewitt, SP, Deutscher, SL & Tanner, JJ Struktur von ligandenfreiem Fab DNA-1 in der Raumgruppe P321, gelöst aus Kristallen mit perfekter hemiedrischer Zwillingsbildung. Proteindatenbank https://doi.org/10.2210/pdb1XF4/pdb (2005).

Kujirai, T., Horikoshi, N. & Kurumizaka, H. Die Kristallstruktur von Anti-H4K20me1_scFv, 15F11. Proteindatenbank https://doi.org/10.2210/pdb5B3N/pdb (2016).

Emsley, P., Lohkamp, ​​B., Scott, WG & Cowtan, K. Merkmale und Entwicklung von Blässhuhn. Acta Crystallogr. D Biol. Kristalllogr. 66, 486–501 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Adams, PD et al. PHENIX: ein umfassendes Python-basiertes System zur Lösung makromolekularer Strukturen. Acta Crystallogr. D Biol. Kristalllogr. 66, 213–221 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Davis, IW et al. MolProbity: All-Atom-Kontakte und Strukturvalidierung für Proteine ​​und Nukleinsäuren. Nukleinsäuren Res. 35, W375–W383 (2007).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Greenfield, NJ Verwendung des als Funktion der Temperatur erfassten Zirkulardichroismus zur Bestimmung der Thermodynamik der Proteinentfaltung und der Bindungswechselwirkungen. Nat. Protokoll. 1, 2527–2535 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, Y. et al. Die Struktur des Triosephosphat/Phosphat-Translokators enthüllt die Grundlage der Substratspezifität. Nat. Pflanzen 3, 825–832 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Webb, B. & Sali, A. Vergleichende Proteinstrukturmodellierung mit MODELLER. Curr. Protokoll. Bioinform. 54, 5 6 1–5 6 37 (2016).

Artikel Google Scholar

Sondergaard, CR, Olsson, MH, Rostkowski, M. & Jensen, JH Verbesserte Behandlung von Liganden und Kopplungseffekten bei der empirischen Berechnung und Rationalisierung von pKa-Werten. J. Chem. Theorieberechnung. 7, 2284–2295 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Olsson, MH, Sondergaard, CR, Rostkowski, M. & Jensen, JH PROPKA3: Konsistente Behandlung interner und Oberflächenreste in empirischen pKa-Vorhersagen. J. Chem. Theorieberechnung. 7, 525–537 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jo, S., Kim, T., Iyer, VG & Im, W. CHARMM-GUI: eine webbasierte grafische Benutzeroberfläche für CHARMM. J. Comput. Chem. 29, 1859–1865 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wu, EL et al. CHARMM-GUI Membrane Builder für realistische biologische Membransimulationen. J. Comput. Chem. 35, 1997–2004 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chamberlain, CA, Hatch, M. & Garrett, TJ Metabolomische und lipidomische Charakterisierung der Oxalobacter formigenes-Stämme HC1 und OxWR durch UHPLC-HRMS. Anal. Bioanal. Chem. 411, 4807–4818 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ames, GF Lipide von Salmonella typhimurium und Escherichia coli: Struktur und Stoffwechsel. J. Bakteriol. 95, 833–843 (1968).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Case, DA et al. AMBER 2017 (San Francisco, University of California, 2017).

Phillips, JC et al. Skalierbare Molekulardynamik auf CPU- und GPU-Architekturen mit NAMD. J. Chem. Physik. 153, 044130 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Maier, JA et al. ff14SB: Verbesserung der Genauigkeit der Proteinseitenketten- und Rückgratparameter von ff99SB. J. Chem. Theorieberechnung. 11, 3696–3713 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dickson, CJ et al. Lipid14: das bernsteinfarbene Lipid-Kraftfeld. J. Chem. Theorieberechnung. 10, 865–879 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kroutil, O., Minofar, B. & Kabelac, M. Struktur und Dynamik solvatisierter Hydrogenoxalat- und Oxalatanionen: eine theoretische Studie. J. Mol. Modell. 22, 210 (2016).

Artikel PubMed Google Scholar

Bayly, CI, Cieplak, P., Cornell, WD & Kollman, PA Eine gut funktionierende, auf elektrostatischem Potential basierende Methode, die Ladungsbeschränkungen zur Ableitung atomarer Ladungen nutzt – das RESP-Modell. J. Phys. Chem. 97, 10269–10280 (1993).

Artikel CAS Google Scholar

Wang, J., Wolf, RM, Caldwell, JW, Kollman, PA & Case, DA Entwicklung und Test eines allgemeinen bernsteinfarbenen Kraftfeldes. J. Comput. Chem. 25, 1157–1174 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Minofar, B. et al. Massen- versus Grenzflächenlösung von Dicarboxylat-Dianionen in wässriger Lösung. Marmelade. Chem. Soc. 126, 11691–11698 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Darvas, M., Picaud, S. & Jedlovszky, P. Molekulardynamiksimulation der Adsorption von Oxalsäure auf einer Eisoberfläche. Chemphyschem 11, 3971–3979 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Riley, JM, Kim, H., Averch, TD & Kim, HJ Wirkung von Magnesium auf die Calcium- und Oxalationenbindung. J. Endourol. 27, 1487–1492 (2013).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Miller, BR 3rd et al. MMPBSA.py: ein effizientes Programm zur Berechnung der freien Energie im Endzustand. J. Chem. Theorieberechnung. 8, 3314–3321 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Michaud-Agrawal, N., Denning, EJ, Woolf, TB & Beckstein, O. MDAnalysis: ein Toolkit für die Analyse von Molekulardynamiksimulationen. J. Comput. Chem. 32, 2319–2327 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chung, LW et al. Die ONIOM-Methode und ihre Anwendungen. Chem. Rev. 115, 5678–5796 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Frisch, MJ et al. Gaussian 16, Revision C.01 (Gaussian, Inc., 2016).

Hohenberg, P. & Kohn, W. Inhomogenes Elektronengas. Physik. Rev. 136, B864–B871 (1964).

Artikel ADS MathSciNet Google Scholar

Kohn, W. & Sham, LJ Selbstkonsistente Gleichungen einschließlich Austausch- und Korrelationseffekten. Physik. Rev. 140, A1133–A1138 (1965).

Artikel ADS MathSciNet Google Scholar

Becke, AD Dichtefunktionale Thermochemie. III. Die Rolle des exakten Austauschs. J. Chem. Physik. 98, 5648–5652 (1993).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Lee, C., Yang, W. & Parr, RG Entwicklung der Colle-Salvetti-Korrelationsenergieformel in ein Funktional der Elektronendichte. Physik. Rev. B Kondensatoren. Materie 37, 785–789 (1988).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Grimme, S., Ehrlich, S. & Goerigk, L. Wirkung der Dämpfungsfunktion in derdispersionskorrigierten Dichtefunktionaltheorie. J. Comput. Chem. 32, 1456–1465 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Shimamura, T., Hirai, T. & Yamashita, A. Kristallstruktur des bakteriellen Oxalattransporters OxlT in einer oxalatgebundenen okkludierten Form. Proteindatenbank https://doi.org/10.2210/pdb8HPK/pdb (2023).

Shimamura, T., Hirai, T. & Yamashita, A. Kristallstruktur des bakteriellen Oxalattransporters OxlT in einer ligandenfreien, nach außen gerichteten Form. Proteindatenbank https://doi.org/10.2210/pdb8HPJ/pdb (2023).

Jaunet-Lahary, T. & Okazaki, KI Daten für „Struktur und Mechanismus des Oxalattransporters OxlT in einem Oxalat-abbauenden Bakterium in der Darmmikrobiota“. Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.7597686 (2023).

Fukuda, M. et al. Struktur eines Nitrat/Nitrit-Antiporters NarK im nitratgebundenen okkludierten Zustand. Proteindatenbank https://doi.org/10.2210/pdb4U4W/pdb (2015).

Fukuda, M. et al. Struktur eines Nitrat/Nitrit-Antiporters NarK im nitratgebundenen, nach innen offenen Zustand. Proteindatenbank https://doi.org/10.2210/pdb4U4T/pdb (2015).

Referenzen herunterladen

Wir danken Dr. Kazuya Hasegawa, Hideo Okumura, Yoshiaki Kawano und Kunio Hirata, SPring-8, für die Unterstützung bei der Sammlung von Röntgenbeugungsdaten; Yayoi Nomura, Yoshiko Nakada-Nakura und Yumi Sato für ihre technische Unterstützung bei der Herstellung von Antikörpern; Kyoko Fujita für ihre technische Unterstützung bei den Funktionstests; und Professor Keietsu Abe für ihre wertvollen Ratschläge zu den OxlT-Funktionstests. Die Synchrotronstrahlungsexperimente wurden am BL41XU und BL32XU von SPring-8 und mit Genehmigung des Japan Synchrotron Radiation Research Institute (JASRI) durchgeführt (Vorschlag Nr. 2012B1096, 2015A1080, 2015B2080). Die Berechnungen wurden teilweise mit dem Research Center for Computational Science, Okazaki, Japan (Projekt: 21-IMS-C175, 22-IMS-C189) durchgeführt. Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt durch JSPS KAKENHI Grant Numbers JP20H03195 (an AY), JP18H02415 (an KO), JP26440086 (an TH) und Research Fund von der Koyanagi Foundation (an AY), der Takeda Science Foundation (an Ta.S.), dem Plattformprojekt zur Unterstützung der Arzneimittelforschung und biowissenschaftlichen Forschung [Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)] von AMED unter der Fördernr. JP20am0101079 (nach SI). Die Autoren danken Enago (www.enago.jp) für die englischsprachige Rezension.

Forschungszentrum für Computerwissenschaften, Institut für Molekularwissenschaft, National Institutes of Natural Sciences, Okazaki, 444-8585, Japan

Titouan Jaunet-Lahary & Kei-ichi Okazaki

Graduate School of Medicine, Universität Kyoto, Kyoto, 606-8501, Japan

Tatsuro Shimamura, Norimichi Nomura, Kouta Hirasawa und So Iwata

Graduiertenschule für Medizin, Zahnmedizin und Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Okayama, Okayama, 700-8530, Japan

Masahiro Hayashi, Naotaka Tsutsumi, Keiichi Kojima, Yuki Sudo und Atsuko Yamashita

RIKEN SPring-8 Center, Sayo, 679-5148, Japan

Tetsuya Shimizu, Masao Yamashita, Teruhisa Hirai und Atsuko Yamashita

School of Pharmaceutical Sciences, Universität Okayama, Okayama, 700-8530, Japan

Naotaka Tsutsumi, Yuta Suehiro und Atsuko Yamashita

Graduiertenschule für Umwelt- und Biowissenschaften, Universität Okayama, Okayama, 700-8530, Japan

Takashi Tamura

Forschungszentrum für fortgeschrittene Wissenschaft und Technologie, Universität Tokio, Tokio, 153-8904, Japan

Hiroko Iwanari und Takao Hamakubo

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Te.H. und AY konzipierte die Studie. Te.S., MY, Ta.S., KH und NN führten eine Proteinreinigung durch. NN, HI, Ta.H. und SI führten eine Antikörpervorbereitung durch. Te.S., MY, AY, Te.H., Ta.S. und KH führten eine Kristallisation und eine Röntgendatenerfassung durch. Ta.S., Te.H., MH und AY führten die Strukturanalyse durch. MH, NT, Yut.S., KK, AY und Yuk.S. führte die Funktionstests durch. TJL und KO führten Molekulardynamik- und QM/MM-Simulationen durch. TT führte eine vorläufige Molekulardynamiksimulation durch. AY, KO, Ta.S., NN, TJL, MH, NT und Yut.S. hat die Arbeit zusammen mit den Beiträgen aller anderen Autoren geschrieben.

Korrespondenz mit Tatsuro Shimamura, Kei-ichi Okazaki, Teruhisa Hirai oder Atsuko Yamashita.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Lan Guan und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Review-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Jaunet-Lahary, T., Shimamura, T., Hayashi, M. et al. Struktur und Mechanismus des Oxalattransporters OxlT in einem Oxalat abbauenden Bakterium in der Darmmikrobiota. Nat Commun 14, 1730 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36883-5

Zitat herunterladen

Eingegangen: 01. November 2021

Angenommen: 20. Februar 2023

Veröffentlicht: 3. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36883-5

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein gemeinsam nutzbarer Link verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.